2 果蝇幼虫唾液腺染色体标本的制备与观察.doc

果蝇幼虫唾腺染色体标本的制备与观察摘要果蝇幼虫唾腺细胞染色体是一种特化的巨大染色体，由于其外形具横纹与胀泡等结构，可作为物种区别标志与基因定位标志。实验采用普通果蝇的三龄幼虫，剥离出其唾腺，通过固定、染色与压片等步骤制成果蝇幼虫唾腺染色体标本，在显微镜下观察，最终对果蝇幼虫唾腺染色体的外形、结构、特征做出简要描述。引言果蝇三龄幼虫的唾腺细胞处于永久早期，染色体解旋呈伸展状态在幼虫发育过程中细胞核中的DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂。复制后的染色单体DNA不分开，这种现象叫做核内有丝分裂，从而形成了多线染色体。加之唾腺细胞中同源染色体互相靠拢在一起呈现一种联会状态，而使其比一般分裂中期体细胞中的染色体长100150倍。由于在唾腺细胞中8条染色体之间以着丝粒互相连结在一起形成染色盘或异染中心，以及同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称作明带、暗带的横纹，这些横纹的位置，宽窄、数目都具有物种的特异性。不同物种，不同染色体的不同部位形态位置是固定的。因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹特征能准确识别各条染色体。另外某染色体上出现的变异，在唾腺染色体相应的臂上就能反映出来，这样这些横纹就成了精确基因定位的“坐标”。将野生型果蝇的带纹与缺失、重复、倒位等突变体的带纹进行比较，就可以将一些基因定位在染色体上。1在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的解旋、膨大形成的疏松区胀泡，其中最大的一个胀泡叫做巴尔比尼氏环。胀泡富含转录出来的RNA，因此不着色，是基因活动的区域。在个体发育的不同阶段，胀泡或巴尔比尼氏环在染色体上出现的部位不同，据此研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。本次实验将通过对果蝇幼虫唾腺染色体标本的制备与观察，了解并掌握果蝇三龄幼虫唾腺的剖离技术，掌握唾腺染色体标本的制备方法，了解唾腺染色体的形态结构特点。1. 实验材料1.1. 生物材料：普通果蝇的三龄幼虫。1.2. 器材：双筒体视解剖镜，显微镜，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，吸水纸等。1.3. 试剂：改良苯酚品红溶液，生理盐水，1mol/L盐酸，蒸馏水。2. 实验步骤2.1. 三龄幼虫的饲养2.2. 剥离唾腺在一干净的载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在瓶壁上即将化蛹的三龄幼虫置于载玻片上。每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。左手持解剖针按压住虫体前端三分之一的部位，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器部位，适当用力向右拉唾腺腺体随之而出。清除多余组织与上面附着的脂肪。2.3. 解离：在唾腺组织上滴一滴1M HCl，解离1-2min ，以松软组织，利于染色体的分散。2.4. 吸去HCl，用水冲洗2-3次。2.5. 染色：滴加改良苯酚品红染液染色，染色时间不可过长，否则背景也着色。2.6. 压片：染色5min后，盖上干净的盖片，并覆一层滤纸。将片子放在实验台上，用大拇指用力压住，并横向单向揉几次（注意不要使盖片移动，用力和揉动是一个方向，不能来回揉）。2.7. 镜检：先用低倍镜进行观察，找到分散好的染色体再转用高倍镜进行观察。3. 实验结果3.1. 结果图示唾腺图1 果蝇幼虫唾腺（含消化道前端）体视显微图（410）染色中心a染色中心b图2 果蝇幼虫唾腺染色体显微图像（1040） 圆圈示染色中心，箭头指出染色臂位置3.2. 结果分析一般实验用的普通果蝇(Drosophila melanogaster 2n8)，其中一对为性染色体(XY或XX)，X染色体为端着丝粒染色体，呈杆状，Y染色休为“J”形，雄果蝇唾腺细胞中的X染色体臂比雌果蝇的稍细；第二对、第三对染色体均为中央着丝粒染色休，呈“V”形；第四对染色体短小，为端着丝粒染色体，呈点状，附在染色盘边缘。1由于唾腺染色体的假联会，X染色体的一端在异染中心上另端游离；而第二，第三对染色体着丝粒在中央，可以从异染中心呈“V”字形向外伸展出四条臂(2L、2R、3L、3R)，Y染色体着丝粒附近的异染色质参与了染色中心的形成。所以理想的片子不管雌雄果蝇的唾腺细胞在显做镜下均可见五条长臂(X、2L、2R、2L、3R)和一条短臂(第四对染色体臂短不易观察)（如图2 a）。在染色体臂上可观察到许多明暗相间的带。（如图2 a、b）本次实验结果中染色体臂较为舒展，染色中心明显。不足在于图2 a中染色体臂末端有所缠，图2 b中的标本染色较浅，又限于放大倍数原因，未能对染色臂末端胀泡结构进行观察与辨认。4. 注意事项4.1. 注意补加生理盐水，剥离出唾腺后及时将玻片移出体视镜灯光，否则唾腺及盐酸、染液易干。同时水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。4.2. 剥离标本后如生理盐水多了，可将玻片略倾斜令液滴缓慢流至边缘吸去，使标本附着在玻片中心，以防将唾腺一起吸走。4.3. 染色液勿过多，否则压片时唾腺易随染色液漂走。如染色时间到后，染色液量少，应再加少许染色液，再盖上盖波片，避免气泡产生。