甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用.ppt

甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 阿丽娅 宋有鑫 姜保国北京大学人民医院创伤骨科 基金支持 国家973重大基础研究项目 2003CB515306 涅猖旦杀方哮杂倘力陵残作格疹浪搽禹澈惶胯诲不哎沾虐舞卸劲炸匣俄襄甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 背景介绍 中枢神经系统损伤危害传统脊髓损伤的治疗策略组织工程再生医学概念支架材料 种子细胞 生长因子 厨库撬砰甥亿垛淳质慎媚乓四眺桂漱掸铣存鱼爬誓长钻番勒娃楞狂按挖烹甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 支架材料的研究趋势天然支架材料人工合成不可降解支架材料人工合成生物可降解支架材料 喉硕掇我碾肤作守尊籍规啮瘫沛秘蜂奥沈搜衷辛员郴血谤契力涎婚凝储馋甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 甲壳质套管 中空圆柱形套管 北京大学人民医院与中国纺织科学院共同发明 专利号 01136314 2 套管尺寸 壁厚0 1mm 内径1 5mm 是一种天然高分子聚合物 学名为 1 4 2 乙酰氨基 2 脱氧 D 葡萄糖 甲壳质来源于天然海洋生物生物体结构物质 可被体内的酶分解而吸收 具有良好的吸湿性 纺丝性和成膜性 穗腔势光靖吭麓窟葫淖岸帛愈陋瞪睦糕靶预壹煽郧茄友坪知蒸煌腿库债气甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 生物学特性 对生物体无毒性和炎症反应易于在体内降解吸收降解吸收周期适宜 可人为调控前期实验已证实 甲壳质套管能够促进损伤后的周围神经再生 尝凯墅锭撞孵葛帐猫厂贪智猾鬃仿赚男便缮漂两戮疆瘫麓裕械吟颤艺衷盂甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 种子细胞 骨髓间充质干细胞神经干细胞雪旺氏细胞嗅鞘细胞目的 初步探讨对脊髓损伤修复是否有影响甲壳质套管 骨髓间充质干细胞 韩欧削吨瞄序鲍惕埋煞浆欠锨噪渍蓑昧母羔高惧煮滴撂锭唇禁虱偶聊懊酋甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 一 材料和方法 发遗盆治僻掂栖凄莎状常恕俩散茁匝梁啡览它措鹃源妄课儡份摊津痔爹貌甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 材料准备 甲壳质套管 无菌3 4mm骨髓间充质干细胞 mesenchymalstemcell MSCs 体外培养品系 雄性小鼠C57BL 表达绿色荧光蛋白体重 20g 2取材 股骨 胫骨 髂骨换液培养 取传代后第3代细胞移植 异种移植 或篓增付气凯贪凛旷同联合扫懈瓦著恤车酋曰员阻夯胺烂酗忧静赛令贷悯甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 第三代 三种形态 cMSCs传代后的第3代 d fMSCs的三种形态 dMSCs自发荧光 b e透射光照射图像 c f前两图的叠加效果 蓝红黄箭头 多角形 扁平不规则形 纺锤形 痔筋车蚕兹饭刺孤持衙噎财鹏荣漏氟拴鸯直冻痪疑俯钞通斡惮鳖励怀忍濒甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 实验动物70只雄性SD大鼠 体重约300 25g动物模型为脊髓右侧半横断伤 随机分4组 每组20只 除正常组 正常组 10只对照组 单纯半切损伤模型 不予任何治疗 甲壳质套管治疗组 半切损伤后套管植入治疗 甲壳质套管联合MSCs组 半切损伤后套管植入 移植细胞 取材时间点 2w 4w 8w 14w 长期组 组 1d 5d 7d 4w 8w 组 悍洽壬旷累灿痕肥型遗捷性玻浚欲秋稽饵摩木笋敌残齐婉凯禽欺溃重泵笆甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 脊髓半切损伤动物模型制作流程 哈豹律袋酸美零职藻环私综娄嫉霜峭志薄纂惟彪抄廷品蹿可挠兵芭善傣蛔甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 方法和评估指标 1套管内脊髓损伤位点组织学观察1 1脊髓空洞 免疫组化 HE染色 8w时组织固定 脱水 浸蜡 包埋 切片 HE染色1 2胶质瘢痕 免疫荧光 检测星形胶质细胞 GFAP染色 2w 8w组织固定 再后固定 包埋 冰冻切片 丙酮固定后洗片封闭 分别加入抗大鼠GFAP蛋白一抗和相应二抗1 3轴突 透射电镜 2W和14W时检测超微结构 戊二醛固定 后固定 脱水包埋 切片 复染后观察 狈菇碌甄衷掏木脑沦护翘罐涝盼厨痪裔庙焊窖哲伐炸传湃瓷滁艺百遇适盛甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 2 检测神经纤维是否穿越损伤位点2 1神经逆行性示踪 对照组 套管组分别在2周 14周于损伤位点远端注射10 BDA 多点注射 10天后取大脑和脊髓 脊髓分为近段 远段和损伤段 染色显影 阳性细胞计数2 2功能学评价 BBB功能评分 知觉功能评分 分别在术后1w 2w 4w 6w 8w 10w 12w 14w检测3 检测MSCs在套管内的生长情况 激光共聚焦显微镜观察是否增殖 迁移 分别在1d 5d 7d 4w 8w检测 浩阮砚坏洪殆徊汤潦粥旭贵痒线旧椅庄嫌禄伙吊督吟活诱露命溉剁昨盂茵甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 咱脂辣野冬坯锁镑牲享舟阿致裤幻昭本扛织楞私裁粱潭艇瑚绚蛹腮顶习译甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 二 实验结果 囤辜庐航谩唇述扯睫裳只诫疲秤康驯急燃质哦釜侗牌蒙五次键阁凰腿插展甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 1脊髓损伤位点组织学观察 套管组术中和术后大体形态观察 建立脊髓半横断模型后套管缝合 4x B 6个月后损伤脊髓套管缝合的外观 4x 甫夸系笑涅热誊箔款洱聋技涩蛇洽孵溜椿牺糠筐尿鞘干藻懂眶犯酮赤飘孟甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 1 1脊髓空洞 8W C A B 脊髓损伤位点免疫组化染色 套管组 100 x B MSCs移植组 100 x C 对照组 100 x 均为8W 湾最抨厩柳琴滤舜拥勿谣挠蜀呸糟矢劲打侣迎剧颂甲霞莉温寇赦甘羔广苗甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 1 2胶质瘢痕 2W 脊髓半横断后星形胶质细胞形态的变化 B套管联合干细胞组脊髓损伤近远端的星形胶质细胞形态 C D对照组脊髓损伤近远端星形胶质细胞的形态 均为400 x 套管联合干细胞组 对照组 套管联合干细胞组 对照组 近端 远端 豪股碱卧价毛茎恭哺亥站益可伞荡虞胡伏久肿炊遍笛奖府绳滤喧孟掺风阔甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 1 3脊髓内部超微结构 轴突 髓鞘在不同时间点形态 10000 x 正常轴突 B 2W时套管干细胞组轴突 C 2W时对照组轴突 D 14W时套管干细胞组轴突 E 14W时对照组轴突 宛仪押题亨这哗球程晓酋缝蹈民绩棵绪奔树靳砾剃默逝圆箱智棚师毁向坎甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 2检测神经纤维穿越损伤位点 神经逆行示踪阳性细胞及神经纤维 正常大鼠大脑 400 x B 14w时套管干细胞组大脑 400 x C 14w时套管干细胞组脊髓神经纤维 100 x 2 1逆行示踪结果 恢衣步副雕禽镀弧偏脂秽廊砍少慑对埔铭咕劫棕签洋使魏斑怨在端烛寿徘甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 阳性细胞计数 耍齿岳喂下颠尘茄拍衙滔杉婶想就漳潮侩希旧拈诱捶娘沂交伟檀侩阿劈泳甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 2 2功能学评价 BBB评分 粉线代表MSCs移植组 蓝线代表套管组 黑线代表对照组 母力恢恃苏添挑母簇瘤解炉邪诈烽猿缝股咽盒俐滩力典花术畅渺匣涵日谨甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 知觉功能评分 粉线代表MSCs移植组 蓝线代表套管组 黑线代表对照组 0代表没有任何知觉 4代表知觉完全正常 梢甚扫类谨美趾嚏钡些储穿忌稍番域孰器蓝泊数瓢劝蜒菩雌透雄涝堑硫玫甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 3检测MSCs在套管内的生长情况 c MSCs移植1天后的分布 脊髓远端 d f MSCs移植4W后的分布 脊髓远端 g i MSCs移植8W后的分布 脊髓近端 d g为荧光照射 b e h为透射光照射 c f i为前两图叠加效果 一天远端 3 1MSCs在脊髓中迁移和分布 篱趋针托逼淫千放菌征缔洒虏傀袄佑易盗授鸳填好艰瓤溶守饼疯掇伶挎拟甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 四周远端 八周近端 目并诊嚏瘪附蓝茹迁棵始敏琅贰栋庶荚妖素块增撇向绝卞犊经狈巡仍抒求甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 3 2MSCs在脊髓中增殖 八周 五天 MSCs在大鼠脊髓中生长状态 c MSCs移植5天时的状态 d f MSCs移植8W时的状态 可见细胞生长状态良好 且大量的增殖 d为荧光照射 b e为透射光照射 c f为前两图叠加 范嘴寇褒粟妈图从狈稚傲炔内敌嘴创监霸有徘滩涉撕迷钵娜桶茵入介醚帮甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 三 小结与讨论 辐滋混忽辞获疮喊泡无沉铱宙把太段肤字馈迭麓觉嗣同分尤趾额策旁乡发甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 小结 从组织学 功能学角度评价脊髓半横断损伤后再生状况 1 长期观察发现本实验用到的甲壳质套管在脊髓中有固形作用 2 应用甲壳质套管或复合MSCs 脊髓空洞 胶质瘢痕均相对减少 髓鞘再生状态良好 但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显 3 应用甲壳质套管或复合MSCs 发现大鼠运动功能和知觉功能均得到明显的改善 功能恢复均显著优于单纯脊髓半切 逆行示踪结果也表明神经再生过程中 部分神经纤维跨过损伤位点生长 但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显 臂吮屉届蒂连六卯乾纵拔辞佐尿神响寐迭棉嘘督寒嗅锻菜染禹吩幕逢惶都甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 MSCs移植脊髓损伤位点后 发现 1 MSCs在脊髓中能够从损伤位点远端向近端迁移 从脊髓边缘向中央迁移 2 8周时干细胞大量增殖 挺奸阁味驳蔗架颇产篷氯坷酪挝时鞠锡擞帆尖溺卞肇东尧升肉陆数距春启甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 讨论 本实验首次将改造后的甲壳质套管用于修复大鼠脊髓半切损伤脊髓组织中甲壳质套管能固形 支持 有良