2.样品功能特性的测定.doc

2.样品功能特性的测定w 2.1待测样品的制备w 待测样品制备时要确保待测样品澄清或没有沉淀物，当按要求进行制备待测样品时（如测定碘价时），必须先干燥待测样品后再进行检测。因为待测样品暴露于光、热或空气中可促进氧化，所以待测样品在储藏过程中避免这些因素的影响可延迟其酸败变质。2.2折光指数法w 原理w 油脂的折射率(RI)定义为光在空气中(真空条件下)与在油中传播速度之比。w 操作步骤w 待测样品油在20-25、脂肪在条件40 下用折光仪进行检测，因为在此温度下大部分固体脂都已液化。w 应用w RI法可用于监控油脂的氢化反应。RI的减少与碘价的下降成线性关系。它还可用于检测纯度、鉴别物质，因为每种物质都有其特定的RI 。2.3 熔点原理： 熔点的测定有多种方式。毛细管熔点法(capillary tube melting point)即最终熔点或液体澄清点，是指在一端封闭的毛细管内，脂肪被加热至完全成为液体时的温度。移动熔点法(slip melting point)的测定类似于毛细管法，即测定在加热条件下脂肪在开口的毛细管中移动时的温度。降落熔点或降落点法(dropping melting point)是测定样品在流过专用炉上加热的样品杯中2.8mm孔时的温度。w Wiley熔点测定的是悬浮在相似密度的酒精一水的混合物中，3.2mm X 9.5mm的片状脂肪变成球状时的温度。2.4 烟点、闪点和燃点w 原理w 烟点是指在指定条件下检测待测样品开始发烟时的温度。w 闪点是指在待测样品表面的任意一点产生火花时的温度，即待测样品迅速产生足够的挥发性气体以提供产生火花的条件。w 燃点是指待测样品发生燃烧时的温度，即待测样品产生的挥发性气体(靠待测样品分解得到)的速度足以维持持续的燃烧w 操作步骤w 将装满油或动物脂的烧杯在光照良好的容器中加热，烟点是指开始有淡淡的蓝色烟雾持续产生时的温度。继续加热，每隔5测定待测样品产生燃烧的温度就可观察到闪点和燃点。对于闪点低于149的油脂，要用密闭的烧杯。应用 这些检测方法针对的是油脂中的挥发性有机物质，特别是游离脂肪酸和残留的萃取溶剂。煎炸用油和精炼油的烟点应该分别高于200或300 。2.5冷冻试验原理 冷冻试验是测定油抗结晶的能力，没有晶体和混浊出现则说明具有相应的防冻能力操作步骤 油在冰浴(0)中放置5.5h,观察其结晶情况。应用 冷冻试验实际就是油的抗冻测定，使其能确保在低温条件下储藏时仍保持清晰透明2.6 浊点原理w 浊点是液体脂肪因为结晶形成而开始出现浑浊时的温度。操作步骤w 待测样品先加热到130，然后搅拌冷却。开始出现结晶时的温度可由浸在油脂中的温度计观察到，必须注意一旦形成结晶后就不能清楚地观察读数了。w 分析步骤w 1取(60-65)g试样加热至130，以保证试样完全干燥。w 2将45ml加热的试样倾入油样瓶，置于冷水浴中摇动使温度均匀。w 3当试样温度下降到浊点以上约10时，开始连续迅速地成圆周动作摇动，以防止过冷导致油脂在瓶壁和瓶底结晶固化。w 4从这时开始，不要从试样中取出温度计，以防止气泡引进而干扰试验。实验过程中应保持瓶内试样液面和冷水浴液面基本一致。w 5定时从冷水浴中取出试样进行观察。当插入试样中的温度计通过瓶子和瓶内试样作横向观察而不能被见到时，此时的温度即为试样的浊点。2.7色泽w 用来测定油脂色泽的两种方法分别是罗维朋法和分光光度法。w 操作步骤w 在罗维朋法中，将待测样品放入一标准尺寸的管子中，与红色和黄色标准系列管进行目视比较。待测样品的测量结果以标准管子的号数表示。此外也可使用自动比色计进行测定。w 在分光光度法中，待测样品于时被置于一比色杯中，然后分别在波长为460nm、520nm、620nm、670nm下测定其吸光度值。光度测定的色泽指数可通过下式计算:光度测定的色泽指数=1.29（A460）+69.7(A550)+41.2（A620）-56.4（A670）2.8 碘价w 1.原理w 碘价是用来测定油脂的不饱和程度。如碳一碳双键的数量与油脂总量的关系。w 碘价定义为每100g待测样品所消耗的碘的克数。油脂不饱和度越高，消耗的碘量就越多。w 因此碘价越高，说明其不饱和程度也越高。w 2.操作步骤w 将一定数量的油脂溶解在溶剂中，与一定量的碘或其他卤素反应。卤素的加入使双键发生反应，碘化钾的加人使过量的氯化碘还原成游离碘。被释放的碘用含淀粉指示剂的硫代硫酸钠标准溶液滴定。碘价可以用下列公式计算:3、应用 碘价被用于油脂功能特性的测定，在油脂提纯过程中可监测其氢化反应。另外，因为脂类在氧化反应时，不饱和度会出现下降，所以也可以用于监测其氧化情况。2.9 皂化值w 1、原理w 皂化是通过强碱与脂肪作用将其分解或降解成甘油或脂肪酸的过程：皂化值(或皂化数)定义为皂化一定数量的油脂所需强碱的总量。具体表达为皂化1g油脂待测样品所需的KOH的毫克数。皂化值是甘油三酯平均分子质量的指数。甘油三酯的平均分子质量除以3可得到其脂肪酸分子质量的近似值。皂化值越小，脂肪酸链就越长。w 2、操作步骤w 在待测样品中加人过量的氢氧化钾乙醇溶液，并将溶液加热至脂肪皂化。未反应的氢氧化钾用含有酚酞指示剂的标准盐酸反滴定，其皂化值按下列公式计算：w 3、应用w 计算皂化值不适用于含有较高含量不皂化物、游离脂肪酸(0.1%)、甘油一酯或甘油二酯的油脂。具体测定法如下：w 1原理:在回流条件下将样品和氢氧化钾-乙醇溶液一起煮沸，随后用标定的盐酸溶液滴定过量的氢氧化钾。 w 2试剂 所有试剂必须是分析纯级，使用水为蒸馏水或与其相当纯度的水。 w 21 氢氧化钾：大约0.5mol/L氢氧化钾溶解在95%（V/V）乙醇中。此溶液应为无色或淡黄色。通过下列任一步骤可制得稳定的无色溶液。 w a. 将8g氢氧化钾和5g铝片放在1L乙醇中回流1h，立刻蒸馏。将需要量的氢氧化钾溶解于蒸馏物中，静置数天，然后倾出清亮的上层清液而除去碳酸钾沉淀。 w b. 加4g特丁醇铝到1L乙醇中，静置数天，倾出上层清液，将需要量的氢氧化钾溶解于其中，静置数天，然后从碳酸钾的沉淀中倾出清亮的上层清液。w 将此液贮存在配有橡皮塞的棕色或黄色玻璃瓶中备用。w 2.2 盐酸标准滴定溶液：0.5mol/L。 w 2.3 酚酞10g/L溶于95%（V/V）乙醇，或碱性蓝6B20g/L溶于95%（V/V）乙醇。 w 2.4 助沸物：玻璃珠或瓷粒。 w 3 仪器 w 3.1 锥形瓶w 3.2 回流冷凝管w 3.3 加热装置：如水浴锅、电热板或其他适合的仪器。不能用明火加热。 w 3.4 滴定管： w 3.5 移液管： w 4步骤 w 4.1 试样量 w 称取2g，准确到0.005g的试验样品于锥形瓶中。w 注：以皂化值170-200为依据，被测样量为2g。对于其他范围皂化值，样量将以约一半氢氧化钾-乙醇溶液被中和为依据而改变。 w 4.2 测定 w 4.2.1 用移液管将25.0mL氢氧化钾-乙醇溶液加到试样中，并加入一些助沸物，连接回流冷凝管与锥形瓶，并将锥形瓶放在加热装置上慢慢煮沸，不时摇动，油脂维持沸腾状态60min。难于皂化的需煮沸2h。 w 4.2.2 加0.5-1mL酚酞指示剂于热溶液中，并用标准体积盐酸溶液滴定到指示剂的粉色刚消失。如果皂化液是深色的，则用0.5-1mL的碱性蓝6B溶液。 w 4.3 空白试验 w 不加试样，再用25.0mL的氢氧化钾-乙醇溶液进行空白试验。 2.10、游离脂肪酸(FFAs)和酸价w 1.原理w 脂肪酸价的测定通常可反映出甘油三酯水解释放的脂肪酸的总量。w 游离脂肪酸(FFA)是以某一脂肪酸质量的百分比(如油酸的百分比)来表示。w 酸价是指中和1g油脂中存在的游离脂肪酸所消耗的氢氧化钾的毫克数。除了游离脂肪酸外，含磷的酸性基团和氨基酸对酸价也有一定的影响。w 可食用油脂的酸价有时可被表示为中和每l00g油脂中的脂肪酸所需要的1mol/L的NaOH的毫升数。w 2、分析步骤w 在液体脂肪待测样品中先加人95%的中性乙醇和酚酞指示剂，然后用氢氧化钠溶液滴定待测样品，其FFA的百分含量可通过下式计算:w 3、应用w 在粗脂肪中，酸价可用于评估去除脂肪酸的精炼过程中油的损耗情况。对于精炼油来说，高的酸价则意味着精炼油的质量差，或者在储藏和使用过程中发生了脂的分解。2.11、稠度w 稠度(也可用塑性、硬度、乳化性和扩展性来描述)是可塑脂肪(如起酥油、人造奶油和黄油)的一个重要特性。w 1、原理w 针入度法是通过测定在一定时间内圆锥形重物穿透人脂肪的距离来测定其稠度。w 2、应用w 针人度法适用于测定塑性脂防和固体脂防乳化液的稠度。w 酸败是指由脂解(水解酸败)或者脂类氧化（氧化酸败）引起的不良气味和味道。是指脂肪酸从甘油酯上水解下来，由于其挥发性，短链脂肪酸的水解常产生不良风味。w 根据油脂发生酸败的原因不同可将油脂酸败分为：（1）水解型酸败：油脂在一些酶/微生物的作用下水解形成一些具有异味的酸，如丁酸、己酸、庚酸等，造成油脂产生汗臭味和苦涩味；（2）酮型酸败：指脂肪水解产生的游离饱和脂肪酸在一系列酶的作用下氧化，最后形成酮酸和甲基酮所致。如污染灰绿青霉、曲霉等；（3）氧化型酸败：油脂氧化形成的一些低级脂肪酸、醛、酮所致。3.1样品的制备w 大多数的测定方法要求脂类萃取在分析之前进行。然而，也有一些方法因食品原料不同而有所改变。w 3.2过氧化值w 1、原理w 过氧化值是指每千克脂肪中含有的过氧化物的毫克当量数( meq）：滴定分析是测定粗脂肪产品中氧化的过氧化物或氢过氧化物的总量。w 2、操作步骤w 将油脂溶解于冰醋酸一异辛烷(3:2）溶液，再加入过量的碘化钾与过氧化物反应，并释放出碘，然后采用淀粉作为指示剂，用NaS2O3标准溶液滴定。w 3、应用w 过氧化值测定的只是氧化反应中的瞬间产物，即过氧化物在形成后马上就会被破坏，并生成别的产物。低过氧化值可能是代表刚开始氧化，也可能代表氧化末期，这必须通过测定过氧化值随时间的变化情况以后才能确定。w 2 过氧化值测定2.1 仪器和用具：碘价瓶: 250ml;微量滴定管;量筒: 5、50ml;移液管;容量瓶: 100、1000ml;滴瓶、烧杯等。2.2 试剂氯仿冰乙酸混合液：取氯仿40ml加冰乙酸60ml，混匀；饱和碘化钾溶液：取碘化钾10g，加水5ml，贮于棕色瓶中；0.01N硫代硫酸钠标准溶液：吸取约0.1N的硫代硫酸钠溶液10ml，注入100ml容量瓶中，加水稀释至刻度;0.5淀粉指示剂w 2.3操作方法称取混匀和过滤的试样23g，注入250ml碘价瓶中，加入氯仿-冰乙酸混合液30ml，立即振动使试样溶解,加饱和碘化钾溶液1ml,加塞、摇匀，在暗处放置3min，加水50ml，摇匀后立即用0.01N硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色时，加淀粉指示剂1ml，继续滴定至蓝色消失为止。同时做不加试样的空白试验。w 2.4结果计算过氧化值按公式(1)计算： (V1 - V2)N0.1269过氧化值(I2%) =100 W式中：V1试样用去的硫代硫酸钠溶液体积，ml；V2空白试验用去的硫代硫酸钠溶液体积，ml；N硫代硫酸钠溶液的当量浓度;W试样重量，g;0.12691mg当量硫代硫酸钠相当碘的克数。 w 油脂中过氧化值的测定方法:（另外一种方法） 试剂乙醚、乙醇、盐酸、饱和碘化钾溶液、三氯甲烷+冰乙酸溶液(2+1)、淀粉指示剂1%、硫代硫酸钠标准溶液0.002mol/L。以上试剂均为分析纯。 试样处理称取35g油脂置于50mL大试管中，加入8mL水，用玻璃棒混匀，再加入10mL盐酸，混匀。放入80100水浴中，每隔510min以玻璃棒搅拌一次，至试样完全消化为止约1h。提取：取出试管，立即加入10mL乙醇混合，冷却后，加入15mL乙醚，加塞振摇1min，加入15mL石油醚，加塞振摇1min，静置1020min，将上清液吸入125mL锥形瓶中，于大试管中再加入15mL乙醚，及15mL石油醚，同上提取，将上清液一同吸入125mL锥形瓶中，置水浴上蒸干，放冷后，直接测定过氧化值。w 过氧化值的测定于锥形瓶的脂肪中加入35mL三氯甲烷+冰乙酸(2+1)，使试样完全溶解，加1.0mL饱和碘化钾溶液，轻轻振摇0.5min，在暗处放置5min取出加入75mL水摇匀，加入1.0mL淀粉指示剂，以0.002mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至蓝色消失为终点，取相同量的三氯甲烷+冰乙酸溶液，碘化钾溶液，淀粉指示剂及水，按同一方法，做试剂空白试验。注： 加入碘化钾后，静置时间长短以及加水量多少，对测定结果均有影响。 过氧化值过低时，可改用0.005N硫代硫酸钠标准溶液进行滴定。3.3胺值和T(totox value)w 1、原理w 胺值是指油脂中的醛基(主要是2-烯醛和2,4-二烯醛)总量.醛基化合物与对-甲氧基苯胺反应产生颜色后，用分光光度法测定。T是用来表示待测样品氧化状态的总体指标，其值等于胺值与二倍过氧化值之和w 2、操作步骤w 将油脂溶解在异辛烷中与甲氧基苯胺反应，10min后在350nm处测吸光度。w 3、应用w 因为在脂类氧化过程中，过氧化值法测得的氢过氧化物的分析值是先升后降，而胺值法测得乙醛的分析值(氢过氧化物的酸败产物)则是不断增加的，所以T在此过程中通常是不断增加的。补充：w 1 油脂酸败试验1.1 间苯三酚试纸法1.1.1 仪器和用具： 恒温水浴锅; 电炉;锥形瓶: 50ml, 插有5cm长玻璃管的胶塞;移液管、棕色瓶等。1.1.2 试剂1.1.2.1 间苯三酚试纸: 取长7cm、宽0.4cm的滤纸条, 浸入0.1%间苯三酚乙醇溶液中,浸泡约3min后取出, 阴干 , 装入棕色瓶中备用;1.1.2.2 直径约2mm的大理石颗粒或碳酸钙;1.1.2.3 盐酸。w 1.1.3 操作方法取间苯三酚试纸条安置在锥形瓶胶塞的玻璃管内, 再取试样5ml注入锥形瓶中, 加盐酸5ml, 摇匀, 立即加入大理石56粒, 塞紧胶塞, 在约25的水浴中放置20min。试纸变红为阳性, 表示有醛类存在, 试样已发生酸败; 试纸呈黄色或橙色时为阴性。w 1.2 间苯三酚乙醚溶液法取试样5ml于试管中, 加入比重1.19的浓盐酸5ml, 用橡皮塞塞好管口, 剧烈振荡10s左右, 再加0.1%间苯三酚溶液5ml, 加塞后剧烈振荡1015s, 使酸层分离。如下层呈桃红色或红色, 表示油脂已经酸败; 如呈浅粉红色或黄色表示未酸败。3、4己醛值测定w 1、原理w 脂类氧化期间会形成各种产物，常见的产物为已醛。顶空法测定己醛是检验脂类氧化程度的方法之一。该法通常直接采用顶空取样分析，这就需要从置有待测样品的密闭容器的顶空获得一定体积的气体来进行色谱分析。3.5硫代巴比妥酸(TBA)测定法w 1、原理w TBA测定法测定脂类氧化的次级产物丙醛，丙醛(包括内醛型产物)与TBA反应产生的有色化合物可通过分光光度法进行测定。因为该反应不是丙醛所特有的反应，所以有时在报道时就把该反应产物说成TBA反应物。待测食品样品或许可直接与TBA反应，但在实际测定中还是经常采用蒸馏法尽量先去除杂质，然后将馏分与TBA反应。w 2、操作步骤w TBA测定法常常要求在分析前先将食品待测样品进行蒸馏。一定量的待测样品与蒸馏水混合，调节待测样品pH至1.2，移入蒸馏瓶中，然后加一定量的BHT（二丁基羟基甲苯）,消泡剂和沸石，快速煮沸，收集前50mL馏分；等分的馏分与TBA试剂混合，并在沸水浴中35min后在530nm处测定吸光度。最后利用标准曲线将吸光度值转换为每千克待测样品含丙醛的毫克数。w 但并非所有脂类氧化体系中都有丙二醛存在，很多链烷醛、链烯醛和2,4-二烯醛也能与TBA试剂反应产生黄色色素(450nm)，但只有二烯醛才产生红色色素(53Onm)，因此，需要在两个最大吸收波长(黄色450nm，红色53Onm)下进行测定。w 3、应用w TBA测定法好于过氧化值法，但是与过氧化值测定一样，所测定的只是氧化的中间产物（如丙醛与其他化合物可迅速发生反应)尽管TBA测定法存在着特异性不够高及需要大量待测徉品(根据方法)的缺点，但该法几乎不加修改就经常用来测定脂肪的氧化程度，特别是对肉制品的测定。w 另一个替代上述分光光度法的测定方法是高效液相色谱法分析蒸馏物中丙醛的含量。w 除了脂肪氧化体系中存在的那些化合物以外，还发现其他化合物也能够和TBA试剂反应生成特征红色色素，因而干扰测定，例如蔗糖和木材熏烟中的某些合物与TBA反应显红色。因此，腌制和熏制的鱼肉加上品用TBA试剂检测脂肪的氧化程度时应进行校正。若一部分丙二醛己经与氧化体系中的蛋白质发生反应，则分析结果偏低，此外，风味评分与TBA值往往不一致，因一定量的油脂氧化所产生的TBA相对值因食品种类而异。丙二醛：GB本方法适用于测定猪油中丙二醛。w 1原理： w 猪油受到光、热、空气中氧的作用，发生酸败反应，分解出醛、酸之类的化合物。丙二醛就是分解产物的一种，它能与TBA(硫代巴比妥酸）作用生成粉红色化合物，在538nm波长处有吸收高峰，利用此性质即能测出丙二醛含量，从而推导出猪油酸败的程度。 w 2试剂： w 2.1 TBA水深液：准确称取TBA（瑞士产品）0.288g溶于水中，并稀释至100mL(如TBA不易溶解，可加热至全溶澄清，然后稀释至100mL)，相当于0.02m。w 2.2三氯乙酸混合液：准确称取三氯乙酸（分析纯）7.5g及0.1g EDTA（乙二胺四乙酸二钠，分析纯）用水溶解，稀释至100mL。w 2.3丙二醛标准储备液：精确称取1,1,3,3-四乙氧基丙烷（E.Mesck 97%）0.315g，溶解后稀释至1000 mL(每毫升相当于丙二醛含量为100 g), 置冰箱保存。 w 2.4丙二醛标准使用液：精确移取上述储备液10 mL稀释至100 mL(每毫升相当于丙二醛量为10g）置冰箱备用。w 2.5氯仿（分析纯） w 3仪器： w 3.1恒温水浴箱： w 3.2离心机2000r/min； w 3.3721型分光光度计； w 3.4100mL有盖三角瓶； w 3.525mL纳氏比色管； w 3.610013mm试管； w 3.7定性滤纸。 w 4操作方法 w 4.1样品处理：准确称取在70水浴上融化均匀的猪油液10g，置于100mL有盖三角瓶内，加入50mL三氯乙酸混合液，振摇半小时（保持猪油融溶状态，如冷结即在70水浴上略微加热使之融化后继续振摇）用双层滤纸过滤，除去油脂,滤液重复用双层滤纸过滤一次。 w 4.2准确移取上述滤液5mL置于25mL纳氏比色管内，加入5mL TBA溶液，混匀,加塞,置于90水浴内保温40min，取出，冷却1h，移入小试管内，离心5min上清液倾入25mL钠氏比色管内，加入5mL氯仿，摇匀，静止,分层，吸出上清液于538nm波长处比色（同时作空白试验）。 w 5计算 w 5.1标准曲线制备：用标准丙二醛浓度分别为1g、2g、3g、4g、5g作上述步聚处理，根据得出吸光度读数作标准曲线。 w 5.2样品测出的吸光度读数，从标准曲线求出相应浓度A，然后按下式计算：w A w 丙二醛含量（mg%）w 10 w 式中：A猪油的相应浓度。 4、脂类氧化评价脂类氧化稳定性w 脂肪抗氧化能力就是所谓的脂类氧化稳定性，由于在实际储存的环境下(通常是室温)或在实际货架寿命期间的氧化稳定性测定而长达数月片至数年的时间，因此现已建立了加速测定法测定脂肪和食品原料的氧化稳定性。加速测定法是人为地给待侧样品提供热量、氧气、金属催化剂、光照或酶解等条件以加速脂类氧化。w 诱导期定义为能测出的腐败前的时间期限或脂肪开始加速氧化前的时间期限。w 4.1、烘箱法w 烘箱法是一种常用的测定脂类氧化稳定性的加速测定法。该法是将一定质量的待测样品加热至某一温度(通常是60)，因为脂肪在此温度下氧化的机理跟室温下的完全相同，但在更高温度（如100）下脂肪发生反应的机理就不同了。4.2、氧弹法w 1、原理w 脂类氧化时会摄取周围环境中的氧。因此可通过测定置于密闭容器中的脂肪从氧化开始到耗尽氧所需的时间来衡量脂类氧化稳定性。w 3、应用w 该法另一个优点是可直接采用食品原料进行测定，而不必进行脂肪萃取。 4.3活性氧法(AOM):w 这是一种广泛采用的检验方法，油脂试样保持在98条件下，不断通入恒定流速空气，然后测定油脂达到一定过氧化值所需的时间。4.4酸败法:w 如AOM法一样，不断通入恒定流速的空气到油中，通常在100进行试验，测定氧化产物电导值的增加，用时间表示脂类氧化“诱导期”的长短，判断氧化作用。5.脂类成分分析方法w 食品或散装油脂中存在的脂类物质可通过测定其各种组分确定其功能特性，其中包括脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯、廿油三酯、固醇、脂溶性色素和维生素；w 另一种方法是按照营养标签对脂肪的分类要求进行分类的，具体分为总脂肪含量、饱和脂肪、多不饱和脂肪和单不饱和脂肪。6.脂肪酸组分和脂肪酸甲酯FAMEs w 1、原理w 在GC分析前，为了增加脂类的挥发性，先对甘油三酯和磷脂进行皂化反应.水解成脂肪酸后，再将其甲酯化成脂肪酸甲酯。w 2、操作步骤w 待测样品与正己烷-异丙醇(体积比3:2）之类的溶剂混合后一起均质，将脂类从食品中萃取出来之后，蒸馏去除溶剂，然后脂类萃取物再与氢氧化钠、甲醇、三氟化硼和正庚烷混合后回流蒸馏(可用硫酸代替三氟化硼)，生成FAMEs。取上层正庚烷溶液，用无水硫酸钠干燥，稀释至5%-10%浓度，最后采用GC法分析测定。3、胆固醇的测定也是利用气相色谱测定方法w GB/T15206-94w 食品中胆固醇的测定方法w 1 主题内容与适用范围w 本标准规定了用分光光度计测定各类动物性食品中胆固醇的方法。w 本标准适用于各类动物性食品中胆固醇的测定。w 2 原理w 当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合反应，产生颜色物质。 因此可先对食品样品进行提取和皂化，用硫酸铁铵试剂作为显色剂，测定食品胆固醇的含量。w 3 试剂w 全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。w 3.1 石油醚。w 3.2 无水乙醇。w 3.3 浓硫酸。w 3.4 冰乙酸：优级纯。w 3.5 磷酸。w 3.6 胆固醇标准物质。w 3.7 胆固醇标准液。w 3.7.1 胆固醇标准储备液（1mg/mL）：精确称取胆固醇100mg，溶于冰乙酸中，并定容至100mL。此液至少在2个月内保持稳定。w 3.7.2 胆固醇标准常备液（100(g/mL）：吸取胆固醇标准储备液10mL，用冰乙酸定容至100mL。此液用时临时配制。w 3.8 铁钒显色剂。w 3.8.1铁钒储备液：溶液4.463g硫酸铁铵FeNH4(SO4)2H2O于100mL85磷酸中，贮于干燥器内，此液在室温中稳定。w 3.8.2 铁钒显色液：吸取铁钒储备液10mL，用浓硫酸定容至100mL。贮于干燥器内，以防吸水。w 3.9 50氢氧化钾溶液：称取50g氢氧化钾，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。w 3.10 5氯化钠溶液：称取5g氯化钠，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。w 3.11 钢瓶氮气：纯度99.99。w 4 仪器和设备w 4.1 实验室常用设备。w 4.2 721型分光光度计。w 4.3 电热恒温水浴。w 4.4 电动振荡器。w 4.5 具玻塞试管：体积100ml、25mL。w 5 操作步骤w 5.1 胆固醇标准线w 吸取胆固醇标准常备液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分别置于10mL试管内，在各管内加入冰乙酸使总体积皆达4mL。沿管壁加入2mL铁钒显色液，混匀，在1590min内，在560575nm波长下比色。以胆固醇标准浓度为横坐标， 吸光度之为纵坐标做标准曲线。w 5.2 样品测定w 5.2.1 食品脂肪的提取与测定w 根据食品种类分别用索氏脂肪提取法、研磨浸提法和罗高氏法提取脂肪。并计算出每100g食品中的脂肪含量。w 5.2.2 食品胆固醇的测定w 将提取的油脂34滴（约含胆固醇300500mg ），置于25mL试管内，准确记录其重量。加入4mL无水乙醇，0.5mL50%氢氧化钾溶液，在65恒温水浴中皂化1h。皂化时每隔2030min振荡一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，冷却。加入3mL5氯化钠溶液，10mL石油醚，盖紧玻塞，在电动振荡器上振摇2min， 静置分层（一般约需1h以上）。w 取上层石油醚液2mL，置于10mL具玻塞试管内，在65水浴中用氮气吹干，加入4mL冰乙酸，2mL铁钒显色液