酶学分析技术.ppt

第七章酶学分析技术 本章内容概要 第一节酶活性测定的基本知识第二节酶活性测定方法及酶学分析的类型第三节同工酶测定第四节酶学分析在临床诊断上的应用第五节酶活性测定最适条件的选择 1 掌握酶活性的国际单位定义 酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式 酶活性测定的连续监测法和定时法的概念 区别和结果的计算方法 酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用 以NAD P H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用 本章教学要求 2 熟悉酶促反应进程 酶促反应底物动力学 酶学分析在临床诊断上的应用 3 了解Km值 Vmax值的应用及Km和Vmax的测定 同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择 第一节酶活性测定的基本知识 酶活性的概念酶活性单位酶活性单位的计算酶促反应进程酶促反应底物动力学 一 酶活性的概念 酶活性即酶促反应速度 指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量 底物浓度为 S 产物浓度为 P 时间为t 反应速度为v v d S dt或v d P dt 注 在实际测定酶促反应速度时 以测定单位时间内产物的生成量为好 二 酶活性单位 定义 指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量 酶活性单位是一个人为规定的标准 惯用单位 酶活性测定方法的建立者所规定的单位 国际单位 1IU指在规定条件 最适pH 最适底物浓度 下 每分钟转化1 mol底物的酶量 单位为IU L Katal单位 1Katal指在规定条件下 每秒钟转化1mol底物的酶量 1Katal 60 106IU 三 酶活性单位的计算 步骤 运用公式进行计算 明确测定方法的酶单位定义 按照酶单位定义确定物质量 体积和时间的单位 计算公式 产物的增加量每单位规定的保温时间1000 ml 酶单位 升 每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量 ml 分光光度法测定的公式 A测定 A对照 V总 106每单位规定的保温时间酶单位 升 L V标实际保温时间 四 酶促反应进程 酶促反应进程曲线 酶量的测定 通过酶活性测定间接测得酶的含量 因此 要准确测定酶量 应使酶浓度 E 与酶促反应速度成正比 即 E d S dt或 E d P dt 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度 即酶促反应初速度 酶活性测定时首先要确定线性期 在此期测定反应速度才能准确代表酶活性 酶的含量 酶活性 酶促反应初速度 五 酶促反应底物动力学 中间产物学说 酶促反应进行时 酶首先与底物结合为中间产物 然后再催化底物反应生成产物 E S ES E P 米 曼氏方程 Vmax S v S Km 上式中v代表反应速度 Vmax代表最大反应速度 S 代表底物浓度 Km称为米氏常数 一 米氏常数的定义 由米 曼氏方程可以导出 Vmax v S Km v 当v 1 2Vmax时 Km S 因此Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度 Km值是酶的特征常数 具有重要的应用价值 二 Km值的应用 1 鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数 在反应条件一定时 只与酶的种类和底物的性质有关 与酶的浓度无关 不同种类的酶其Km值不同 对于一种未知的酶 可在规定的条件下测定其Km值加以鉴定 表7 1某些酶的Km值 酶底物Km mmol L 乳酸脱氢酶丙酮酸0 017己糖激酶D 葡萄糖0 05D 果糖1 5 半乳糖苷酶D 乳糖4 0碳酸酐酶H2CO39 0过氧化氢酶H2O225蔗糖酶蔗糖28糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸108 2 反映酶与底物的亲合力 Km值越大 酶与底物亲合力越小 Km值越小 酶与底物亲合力越大 3 选择酶的最适底物 Km值取决于酶的种类和底物的性质 在酶一定时 不同底物有不同的Km值 酶活力测定时 应优先选择酶的最适底物 使酶促反应容易进行 并节省底物用量 4 计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率 根据米 曼氏方程可以计算 5 设计适宜的底物浓度 酶促反应进程曲线表明 只有初速度才能真正代表酶活性 一般要求初速度达到最大速度的90 95 底物消耗率为1 5 这样既可以近似地表示酶活性 又不致于使底物浓度过高而造成浪费 三 Vmax的应用 定义 Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度 应用 Vmax可用来计算酶的转化率 TN 即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数 单位为分子数 秒 当反应速度达到最大反应速度时 如果已知酶量 则可计算出酶的转化率 TN 底物转化量 mol s 酶量 mol 四 Km和Vmax的测定 1 Linweaver Burk作图法 又称为双倒数作图法 1Km S Km11 vVmax S Vmax S Vmax 2 Cornish Bowden作图法 又称为直线线性作图法 第二节酶活性测定方法及酶学分析的类型 酶活性的测定方法工具酶酶偶联测定法底物浓度测定 一 酶活性的测定方法 按照对酶促反应时间的选择不同 连续监测法 固定时间法 一 固定时间法 分类 终点法 在反应进行到预定时间后要终止反应 两点法 该方法反应时间的预定是从t1 t2 定义 测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量 特点 优点是简单 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期 注意 固定时间法时间段的预定不宜太长 一般以30 60分钟为宜 二 连续监测法 原理 定义 测定底物或产物随时间的变化量 又称为速率法 该方法每隔一定时间 10s 60s 测定一次底物或产物的变化量 连续测定多点 然后将测定结果对时间作图 绘制反应速度曲线 特点 在方法设计上 选择紫外吸收法或色原显色法 缺点 要求高 要求能够精确地控制温度 pH值和底物浓度等反应条件 要求仪器具有恒温装置及自动监测功能 半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求 优点 能动态观测酶促反应进程 可以明显地找到反应的线性期 结果准确可靠 标本和试剂用量少 可在较短时间内完成测定 二 工具酶 定义 偶联 工具酶与待测酶 工具酶与工具酶之间的联合 工具酶 将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶 工具酶有氧化还原酶类 转移酶类和水解酶类 分类 表7 2常用工具酶的名称及其缩写符号 名称缩写符号名称缩写符号 乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶MDH6 磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶POD 己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇酯酶CE脲酶肌酐酶 三 酶偶联测定法 应用 对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应 ExEaEiABCP 式中A为底物 B C为中间产物 P为产物 必须能够直接测定 Ex为待测酶 Ea Ei都为工具酶 按照工具酶作用的不同 Ea又称为辅助酶 Ei又称为指示酶 CP称为指示反应 一 酶偶联反应的原理 在应用酶偶联法测定时 关键在于确定恒态期 因为只有恒态期才能代表酶活性 如酶促反应底物动力学所述 恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定 二 常用指示酶及其指示反应 1 脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD P H为辅酶的脱氢酶 例如LDH MDH G6PD GLDH等 它们催化下列反应 P NAD P H H PH2 NAD P 可对NAD P H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定 应用 ALT AST CK等酶活性测定 2 过氧化物酶 POD可催化过氧化氢与某些色原反应 例如与4 氨基安替比林 4 AAP 和酚反应 将其氧化为有色物质 反应如下 POD2H2O2 4 AAP 酚醌亚胺 红色 4H2O Trinder反应 应用 GOD COD GPO 甘油氧化酶 尿酸酶 属于氧化酶类 等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢 因此都可以与POD偶联 通过Trinder反应加以测定 四 底物浓度测定 利用酶催化反应的高效率和专一性 可以测定底物浓度 与酶活性测定类似 第三节同工酶测定 同工酶的定义同工酶产生的机理同工酶的测定方法 同工酶的定义 是催化功能相同 但是分子组成及理化性质不同的一组酶 是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体 纯聚体或杂多体 一 同工酶产生的机理 一 由不同基因位点编码 二 由等位基因编码 三 由多肽链化学修饰产生 二 同工酶的测定方法 一 按照理化性质不同进行分离鉴定 1 电泳法同工酶氨基酸组成不同 等电点不同 电泳迁移率也就不同 据此可用电泳法分离鉴定 2 层析法 根据同工酶分子荷电量不同 可用离子交换层析法加以分离 二 按照底物专一性不同进行鉴定 同工酶底物专一性不同 Km值也不同 如果同工酶之间的Km值差别足够大 可以通过测定其Km值加以鉴定 三 按照最适pH不同进行鉴定 同工酶分子氨基酸组成不同 最适pH也不同 如果同工酶最适pH之间的差别足够大 可以通过调节缓冲溶液的pH值加以鉴定 四 按照免疫学特性不同进行分离鉴定 五 按照耐热程度不同进行鉴定 六 选择性抑制法 第四节酶学分析在临床诊断上的应用 血浆酶的来源酶的区域化分布酶活性测定在临床诊断中的应用同工酶的诊断价值 一 血浆酶的来源 血浆酶 血浆特异酶 非血浆特异酶 外分泌酶 细胞内酶 二 酶的区域化分布 表7 3诊断常用血清酶的来源 血清酶符号来源 鸟氨酸氨基甲酰转移酶OCT肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶LCAT肝谷氨酸脱氢酶GLDH肝山梨醇脱氢酶SDH肝丙氨酸氨基转移酶ALT肝 肾 心异柠檬酸脱氢酶ICD肝 胎盘 心 谷氨酰转肽酶 GT肝 胆 肾 小肠5 核苷酸酶5 NT肝 胆道单胺氧化酶MAO肝 肾 脑天门冬氨酸氨基转移酶AST心 肝 骨骼肌肌酸激酶CK骨骼肌 心 脑乳酸脱氢酶LDH心 肾 骨骼肌 肝 肺碱性磷酸酶ALP小肠 胎盘 肝 肾酸性磷酸酶ACP前