双腔搅拌式生物反应器提高β-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果.doc

www.CRTER.org黎健伟，等. 双腔搅拌式生物反应器提高-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果双腔搅拌式生物反应器提高-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果黎健伟1，赵 辉1，张晓强2，王 磊1，夏立恒1，金 丹1，王 钢1，余 斌1 (1南方医科大学南方医院创伤骨科，广东省广州市 510515；2洛阳市正骨医院骨科，河南省洛阳市 471000)文章亮点：实验的特色在于将实验室自行研发的一种可进行成骨及成软骨双向诱导分化的双腔搅拌式生物反应器应用于组织工程研究。与以往的搅拌式生物反应器相比，此生物反应器在提供应力刺激的同时可以对一块组织工程支架进行成骨和成软骨双相诱导，显著提高了工程化骨与软骨复合体的构建效率，提高了关节软骨缺损的修复效果。关键词：生物材料；软骨生物材料；组织工程；骨髓间充质干细胞；-磷酸三钙；生物反应器；骨软骨；山羊主题词：生物相容性材料；组织工程；生物反应器；干细胞；复合体基金资助：广东高校优秀青年创新人才培养计划项目(育苗工程LYM11041)摘要背景：前期实验自行研发了一种可进行成骨及成软骨双向诱导分化的双腔搅拌式生物反应器。目的：探索双腔搅拌式生物反应器的力学刺激能否提高组织工程骨软骨修复山羊膝关节缺损的效果。 方法：取青山羊12只，制作双侧后肢股骨内髁骨软骨缺损，随机分组，实验组与对照组缺损处均植入在双腔搅拌式生物反应器中进行成软骨、成骨诱导2周的自体骨髓间充质干细胞与-磷酸三钙复合体，不同的是实验组将双腔搅拌式生物反应器置于磁力搅拌仪上给予力学刺激，对照组未给予力学刺激；空白对照组不做处置。植入后12，24周进行大体观察，Masson染色、型胶原免疫组织化学染色和组织学评分。 结果与结论：实验组与对照组均有新生软骨与骨组织生成，实验组修复骨缺损效果明显优于对照组(P 0.05)；空白对照组无新生软骨生成。表明通过双腔搅拌式生物反应器体外培养阶段的力学刺激，可以改善以山羊骨髓间充质干细胞为种子细胞、-磷酸三钙为支架的组织工程骨软骨复合物对膝关节缺损的修复效果。黎健伟，赵辉，张晓强，王磊，夏立恒，金丹，王钢，余斌. 双腔搅拌式生物反应器提高-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果J.中国组织工程研究，2014，18(3):377-382.Double-chamber stirred bioreactor improves the repaired effect of beta-tricalcium phosphate on goat knee cartilage defects Li Jian-wei1, Zhao Hui1, Zhang Xiao-qiang2, Wang Lei1, Xia Li-heng1, Jin Dan1, Wang Gang1, Yu Bin1 (1Department of Orthopedics and Traumatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopedics, Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital, Luoyang 471000, Henan Province, China)黎健伟，男，1979年生，广西壮族自治区南宁市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨与软骨组织工程研究。 通讯作者：黎健伟，主治医师，南方医科大学南方医院创伤骨科，广东省广州市 510515doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.008 中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2014)03-00377-06稿件接受：2013-10-30Li Jian-wei, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics and Traumatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, CCorresponding author: Li Jian-wei, Department of Orthopedics and Traumatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2013-10-30AbstractBACKGROUND: A preliminary experiment developed a double-chamber stirred bioreactor which can carry out osteogenic and cartilage induction at the same time. OBJECTIVE: To explore the effects of double-chamber stirred bioreactor on the repair of goat knee cartilage defects with tissue-engineered cartilage.METHODS: Twelve goats were selected to make bilateral femoral condyle osteochondral defects models and randomized to three groups: experimental group, implanted with the composites of -tricalcium phosphate and bone marrow mesenchymal stem cells that were subjected to 2-week chondrogenic and osteogenic induction simultaneously in the double-chamber stirred bioreactor under mechanical stimulation; control group, implanted with the composites of -tricalcium phosphate and bone marrow mesenchymal stem cells that were subjected to 2-week chondrogenic and osteogenic induction simultaneously in the double-chamber stirred bioreactor; blank control group, without treatment. After 12 and 24 weeks of implantation, general observation, Masson staining, II collagen immunohistochemical staining and histological scoring were performed. RESULTS AND CONCLUSION: In the experimental and control groups, new cartilage tissue and bone tissue were visible, but the experimental group showed better repair effects than the control group (P 99%上海贝奥路生物材料有限公司DMEM培养基、胎牛血清Hyclone 公司，美国地塞米松、胰岛素、胰酶、抗坏血酸、-磷酸甘油钠、转铁蛋白、胰蛋白酶Sigma公司，美国转化生长因子1Peprotech公司，美国实验动物：10月龄雄性中国青山羊12只，体质量24- 32 kg，购于南方医科大学实验动物中心，随机分为实验组、对照组及空白组，每组4只。实验中对动物的操作符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的关于善待实验动物的指导性意见7。双腔搅拌式生物反应器：反应器是作者所在实验室自行设计，交玻璃仪器厂制作完成的，此双腔搅拌式生物反应器在提供应力刺激的同时可以对一块组织工程支架进行成骨和成软骨双相诱导。实验方法：山羊自体骨髓间充质干细胞的分离及培养：穿刺部位经利多卡因局部浸润麻醉，髂骨穿刺抽取实验组与对照组山羊骨髓10 mL，置于含肝素的DMEM培养基中，180g离心10 min，吸取上清液，将沉淀接种于25 cm2培养瓶8。每3 d换液1次并于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，当细胞约80 %融合后，按13比例进行传代扩大至第3代，采用流式细胞术对细胞进行鉴定。在双腔搅拌式生物反应器内构建骨软骨复合体：-磷酸三钙和生物反应器部件先经环氧乙烷消毒，然后将第3代骨髓间充质干细胞以51010 L-1的浓度接种于-磷酸三钙支架内，先将此“细胞-支架”复合物于恒温培养箱内培养1周，以促进细胞与支架表面的黏附，进行倒置显微镜和扫描电镜观察。复合培养1周后置于组装双腔搅拌式生物反应器。组装双腔搅拌式生物反应器：生物反应器由两个圆柱形玻璃器皿组成，两玻璃容器之间由隔板隔开，强力夹子固定。隔板中央有4个直径 6 mm的孔道，将骨软骨复合体插入隔板孔内，2.0 mm长的支架软骨段位于软骨室， 10 mm长的骨段位于骨室内，缝隙以1.2%藻酸钠与 102 mmol/L 氯化钙交联形成的凝胶封闭9；玻璃器两侧上方有培养基注入孔、通气孔等，两侧底部各有一出液口，可以向双腔室内分别注入成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清、高糖DMEM、 100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L -磷酸甘油和50 mg/L抗坏血酸)及成软骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清、高糖DMEM、6.25 mg/L胰岛素、 6.25 mg/L 转铁蛋白、50 mg/L抗坏血酸、100 nmol/L 地塞米松及10 g/L 转化生长因子1)10。实验组组装及添加培养基完成后将其置于磁力搅拌仪上给予力学刺激，转速 300 r/min，每天1 h，每3 d换液1次。对照组未置于磁力搅拌仪上。 修复山羊膝关节骨软骨缺损：生物反应器内培养2周后，将体外构建的骨软骨复合物植入山羊膝关节骨软骨缺损处。将实验动物麻醉后固定于右侧卧位，后肢左膝髌骨内侧切口，切开关节囊，于股骨内髁负重区用外径为6 mm的环锯，建立直径6 mm、深度12 mm的骨软骨缺损模型，实验组与对照组植入直径6 mm、长度12 mm的自体“骨髓间充质干细胞+-磷酸三钙”生物陶瓷复合物，表面以复合有自体骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶覆盖。同样方法于山羊的后肢右膝进行手术，术后不制动。 主要观察指标：植入后12，24周取出膝关节标本分别进行大体观察，石蜡切片Masson染色及型胶原免疫组织化学染色，并行 ODriscoll Keeley and Salter评分11。正常软骨评分24分，修复组织形态评分越高，越接近正常软骨。统计学分析：统计学处理由赵辉完成，组织学评分结果采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，结果以s的形式描述，每个时间点各组间比较采用两样本t 检验进行统计学分析，P 0.05时为差异有显著性意义。 2 结果 Results2.1 骨髓间充质干细胞的分离鉴定 经流式细胞仪鉴定细胞阳性表面标志物，CD29为99.86%，CD44为 98.99%，CD90为99.49%；阴性表面标志物，CD45为 1.26%，CD34为2.16%，CD106为1.75%；证实分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞，纯度高。2.2 -磷酸三钙与山羊骨髓间充质干细胞的复合 倒置显微镜和扫描电镜结果示，细胞在支架周边及支架内部增殖和贴附情况良好，说明支架材料的生物相容性较好(图1A，B)；1周后将复合物培养于双腔搅拌式生物反应器内，未发现有污染现象(图1C，D)。2.3 膝关节修复效果大体观察 两时间点内山羊无死亡，双膝关节活动正常，术区无感染及支架脱出。12周时，实验组缺损处的新生软骨呈乳白色，缺损修复较为平整，与周围正常关节软骨连续性较好(图2A1)；对照组缺损处可见部分软骨样组织，缺损修复不平整(图2 A2)；空白组无新生软骨出现(图2A3)。24周时，实验组缺损软骨修复处外观呈白色半透明，关节面较为平整，与周围连续性较好(图2A4)；对照组部分修复，中心部位关节面仍不平整，但较12周时有所改善(图2A5)；空白组仍无软骨形成，关节面塌陷(图2A6)。2.4 膝关节修复效果组织学观察 软骨基质Masson染色：实验组植入12周可见新生软骨及软骨下骨呈亮绿色，表面较平整，可见软骨陷窝结构(图2B1)；植入24周染色较12周加深，软骨陷窝排列规则，表面平整(图2B2)。对照组植入12周新生软骨部分呈亮绿色，软骨陷窝紊乱，表面粗糙(图2B3)；植入24周软骨基质着色区域较12周大，但是不及实验组，软骨陷窝排列稍规则，表面仍粗糙(图2B4)。空白组术后12周未见有新生软骨(图2B5)；术后24周仍未见有新生软骨陷窝结构(图2B6)。型胶原免疫组织化学染色：因空白组关节缺损表面无新生软骨生长，仅对两实验组的标本行型胶原免疫组织化学检测。实验组12周时软骨缺损处型胶原染色呈阳性表达(图2C1)；24周时，型胶原染色强度加深，胶原表达量较对照组多(图2C2)。对照组12周时染色较浅，胶原纤维结构紊乱(图2C3)；24周时型胶原纤维排列较12周时规整，但是陷窝结构少，着色浅，未发现细胞有老化及组织退化现象(图2C4)。2.5 膝关节修复效果组织学评分 ODriscoll Keeley and Salter评分结果见表1所示，实验组植入后12周和24周评分均优于对照组(P 0.05)。表1 在羊股骨内髁骨软骨缺损内植入不同材料12，24周后的ODriscoll Keeley and Salter评分Table 1 ODriscoll, Keeley and Salter scores at 12 and 24 weeks after implanted scaffolds in femoral condyle osteochondral defect of goat knee (s)组别12周24周实验组16.000.81618.750.957对照组11.000.816a14.750.957a空白组00表注：实验组与对照组缺损处均植入在双腔搅拌式生物反应器中进行成软骨、成骨诱导2周的自体骨髓间充质干细胞与-磷酸三钙复合体，不同的是实验组将双腔搅拌式生物反应器置于磁力搅拌仪上给予力学刺激，对照组未给予力学刺激；空白组不做处置。结果表明通过双腔搅拌式生物反应器体外培养阶段的力学刺激，可以改善以山羊骨髓间充质干细胞为种子细胞、-磷酸三钙为支架的组织工程骨软骨复合物对膝关节缺损的修复效果，与实验组比较，aP 0.05。DCBA图1 -磷酸三钙生物陶瓷与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养于双腔搅拌式生物反应器Figure 1 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells and -tricalcium phosphate co-cultured in a double-chamber stirred bioreactor图注：图中A为扫描电镜下观察支架内的骨髓间充质干细胞贴附良好(5 000)。B为倒置显微镜镜下观察生物陶瓷周围细胞增殖状况良好(40)。C为双腔搅拌式生物反应器组装图。D为用于放置支架的双腔搅拌式生物反应器隔板。A4A3A2A1B2B1A6A5B6B5B4B3C4C3C2C1图2 在羊股骨内髁骨软骨缺损内植入不同材料12，24周后的大体观察及Masson染色与型胶原免疫组织化学染色Figure 2 General observation, Masson staining and II collagen immunohistochemical staining at 12 and 24 weeks after scaffolds implantation in femoral condyle osteochondral defects of goat knee图注(1) 图中A为大体观察，B为Massom染色(40)，C为型免疫组织化学染色(200)。(2) 图中A1为实验组植入骨软骨复合物12周，缺损处的新生软骨呈乳白色，缺损修复较为平整，与周围正常关节软骨连续性较好。A2为对照组植入12周，缺损处可见部分软骨样组织，缺损修复不平整。A3为空白组术后12周，无新生软骨出现。A4为实验组植入24周，缺损软骨修复处外观呈白色半透明，关节面较为平整，与周围连续性较好。A5为对照组植入24周，缺损软骨部分修复，中心部位关节面仍不平整，但较12周时有所改善。A6为空白组术后24周，仍无软骨形成，关节面塌陷。(3) 图中B1为实验组植入12周，可见新生软骨及软骨下骨呈亮绿色，表面较平整，可见软骨陷窝结构。B2为实验组植入24周，染色较12周加深，软骨陷窝排列规则，表面平整。B3为对照组植入12周，新生软骨部分呈亮绿色，软骨陷窝紊乱，表面粗糙。B4为对照组植入24周，软骨基质着色区域较12周大，但是不及实验组，软骨陷窝排列稍规则，表面仍粗糙。B5为空白组术后12周未见有新生软骨。B6为空白组术后24周仍未见有新生软骨陷窝结构。(4) 图中C1为实验组植入骨软骨复合物12周时软骨缺损处型胶原染色呈阳性表达。C2为实验组植入24周时型胶原染色强度加深，胶原表达量较对照组多。C3为对照组植入软骨复合物12周时软骨缺损处型胶原染色较浅，胶原纤维结构紊乱。C4为对照组植入软骨复合物24周时型胶原纤维排列较软骨复合物12周时规整，但是陷窝结构少，着色浅，未发现细胞有老化及组织退化现象。www.CRTER.org黎健伟，等. 双腔搅拌式生物反应器提高-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果3 讨论 Discussion生物反应器是目前组织工程领域的研究热点之一，其原理是在体外模拟机体内部细胞、组织生存的微环境，以促进组织的再生12。组织工程领域常用的生物反应器包括灌注式13、搅拌式及旋转壁式等6, 14。生物反应器提供的应力刺激，可以促进细胞的代谢速率、增殖活性、表型维持及功能发挥，应力刺激下软骨细胞分泌的糖胺多糖含量可以高出静态培养40% 15，培养液中胰岛素样生长因子和转化生长因子1也比静止培养组多16-17；而缺乏应力刺激可导致种子细胞功能发挥不完全及组织生物活性较低18。有研究发现，充足的营养物质供给对于体外构建工程化组织的效果而言非常关键，当细胞团直径超过1 mm，其中心区域细胞便会出现功能障碍19；种植在聚羟基乙酸支架的软骨细胞，位于材料表面0.4 mm以内即会出现糖胺多糖的沉积减少20。但如果能够及时改善支架中的物质交换，复合骨髓间充质干细胞的组织工程骨2周时就可出现局部钙化点，7周左右细胞周围便可生成骨样组织21。可见，应力刺激对于工程化组织的构建效率具有明显的促进作用。-磷酸三钙具有良好的生物相容性和降解性，其作为一种良好的生物材料已被骨组织工程领域广泛接受22。同时，已有研究者使用-磷酸三钙复合软骨细胞或骨髓间充质干细胞成功进行了组织工程软骨的构建23-24。接种了软骨细胞和成骨细胞的生物支架在双腔搅拌式生物反应器中，可以分别在各自接种的部位形成组织工程骨软骨25；但是，由于这两种细胞来源有限，而且传代后的软骨细胞容易发生去分化，限制了该方法在临床的应用。干细胞具有多向分化能力，用它作为种子细胞不仅可以解决来源有限的问题，而且还让同时构建骨软骨复合体成为可能24。因此实验选择以骨髓间充质干细胞作为种子细胞，在-磷酸三钙上同时进行组织工程骨软骨构建用于修复关节软骨缺损的方法是可行的。但由于成骨和成软骨诱导培养基的成分差别较大，若要在在同一支架材料上同时进行骨髓间充质干细胞的成骨和成软骨诱导，必须设法将支架分隔为两节段，并且将两节段分别置于相应的诱导液内。因此，作者所在实验室自行设计了双腔搅拌式生物反应器，使用藻酸钙凝胶封闭的方法形成两完全分隔的腔室，以便同时进行成骨与成软骨诱导。实验的体外培养方法，不仅克服了两种细胞源获取困难的难题，而且解决了不易同时构建的问题。通过双腔搅拌式生物反应器各腔室内磁力转子的搅拌，不仅对生物材料内的细胞提供了力学刺激，而且可以加速支架内细胞的物质交换速率，从而促进工程化组织的生长及分化。为了研究早期力学刺激对体外培养细胞体内成软骨的影响，作者在体外诱导一段时间后才将支架植入软骨缺损处，一方面可以验证生物反应器的效果，另一方面可以给细胞足够的时间分泌细胞外基质，以牢靠的贴附在支架内，避免植入后发生细胞脱落。成年山羊膝关节软骨厚度约为1.5 mm，常用软骨缺损直径为6.0-7.0 mm。若山羊股骨内髁的骨软骨缺损深度在3 mm以上，直径5 mm以上，将不能被自身修复26。因此选择了直径6 mm，深度12 mm的骨软骨缺损。术后12周及24周的大体观察、组织学检测和评分结果均显示，山羊“骨髓间充质干细胞+-磷酸三钙”骨软骨复合物植入山羊膝关节股骨内髁负重部位可有新生软骨和骨组织生成；并且，经过双腔搅拌式生物反应器体外双向诱导2周后的力学刺激组，修复效果明显优于未经力学刺激组。说明了对-磷酸三钙内骨髓间充质干细胞进行双向诱导后进行软骨缺损修复，修复效果是可以肯定的；而且，前期的力学刺激能明显提高体内成软骨效果。这可能由于力学刺激模拟了软骨体内所受的应力环境，促进了骨髓间充质干细胞向软骨方向分化5；前期的力学刺激促进了反应器内诱导培养基的营养物质和细胞因子等成分分布更为均衡，更有利于进入-磷酸三钙生物材料的微孔中与细胞进行物质交换；力学刺激同时加速软骨细胞的新陈代谢，活力提高后的细胞在植入体内后可以提高软骨基质的分泌能力15。在生物反应器中，经诱导已经分化的骨髓间充质干细胞，在植入体内后仍然可以促进周围的骨髓间充质干细胞分别继续向软骨细胞和成骨细胞分化；而且，植入关节后，支架局部的内环境也可促进骨髓间充质干细胞向毗邻组织的方向分 化27。在以上因素的综合作用下，“骨髓间充质干细胞+-磷酸三钙”骨软骨复合物经过2周双腔搅拌式生物反应器的体外培养，较好、较快地修复了不可自行修复的山羊膝关节骨软骨缺损。实验证明，通过2周双腔搅拌式生物反应器体外诱导培养阶段的力学刺激，可改善以山羊自体骨髓间充质干细胞为种子细胞、-磷酸三钙为支架的组织工程骨软骨复合物修复膝关节缺损的效果。致谢：感谢广东省骨与软骨再生医学重点实验室赵培冉老师对本实验组织学研究部分所提供的帮助。作者贡献：黎健伟进行实验设计，实验实施为黎健伟、赵辉、张晓强，实验评估为王磊，资料收集为张晓强，王磊、夏立恒成文，金丹、王钢、余斌审校，黎健伟对文章负责。利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。伦理要求：对实验动物的操作符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的关于善待实验动物的指导性意见。学术术语：生物反应器-是在体外模拟机体内部细胞、组织生存的微环境，以促进组织的再生。组织工程领域常用的生物反应器包括灌注式、搅拌式及旋转壁式等。作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。4 参考文献 References1 Martin I,Miot S,Barbero A,et 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