土壤酶的测定方法.doc

一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。1、试剂配制：（1） pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。（2） 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9，溶液稳定。（4） 10尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5） N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2、操作步骤称取5土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(6.7),仔细混匀。在37恒温箱中培养24。然后用热至38的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20后,将混合物稀释至刻度,在波长578处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）UreaVn/m式中：a为由标准曲线求得的NH3N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。二. 过氧化氢酶测定(容量法)（比较好测）1. 试剂配制 a. 0.3过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释 b. 3N 硫酸（？） c. 0.1N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。2. 操作步骤（1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3H2O2溶液。（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3过氧化氢溶液，而不加土样。（3）将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。3. 结果计算 用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。 （A-B）T即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。（？）式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。（就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量）高锰酸钾溶液标定称取0.2g（准至0.0001g）于105110烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液c（KMnO4）=0.1mol/l滴定，近终点时加热至65，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中 c（1/5KMnO4）=高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L； m草酸钠之质量，g； V1高锰酸钾溶液之用量，mL； V2空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；0.06700与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。三、蔗糖酶测定（比色法）：1、试剂配制（1）3，5二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5mL即成。（3）8蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中（4）甲苯（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水中，即成标准葡萄糖溶液(5mg还原糖/mL）。再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液(0.5mg/mL）。2、操作步骤称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL 8蔗糖溶液，5mL pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。3、结果计算以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：SucaVn/m式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：土壤磷酸酶是植物根系与微生物的分泌产物。磷酸酶与土壤P素转化密切相关，是土壤P素肥力的指标。1、试剂配制（1）甲苯（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）（3）缓冲液（4）p9.0硼酸盐缓冲液缓冲溶液配制：(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA3mLB混合即得（2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）硼砂氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中50mLA43mLB加水稀释至200mL，混匀即得（3）硼酸盐缓冲液（pH9.0）A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL蒸馏水中B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O）溶于1000mL蒸馏水中柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得（5）2.5铁氰化钾（6）0.5的4氨基安替吡啉溶液（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）2、操作步骤： 称取5土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。再加入5mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶用p5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液)，同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。仔细摇匀后放入恒温箱,在37下培养24。用热至38的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL p9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5的铁氰化钾和3mL 0.5的4氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。标准曲线：分别向100mL容量瓶中注入1，3， 5，7，9，11mL工作液并显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。5脱氢酶测定（比色法）取20g土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸钙。混匀后加2ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%，在恒温恒湿培养箱中（30，相对湿度70%）培养24h。培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min，过滤。再用甲醇多次洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液