实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定.doc

实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定一、 实验内容1 利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白。2 采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量。3. 对以上蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。4. 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行Western blotting鉴定。二、 实验目的和要求1 了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法。2 熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3 掌握SDS-PAGE的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4 掌握Western blotting操作方法。三、 实验仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液枪及枪头、微量离心管（又称Eppendorf 管）、50ml离心管、常用玻璃器皿（见表1）、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系统。（二）试剂准备1Buffer I（2000ml）：20mM Tris-Cl, pH8.0 。2Buffer II（500ml）：Buffer I含有0.5M NaCl。四、实验操作（一）动物肌肉蛋白的提取1称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉，用刀切碎，称取3g左右，加入 30 ml 左右冰冷的Bufffer I（鱼肉g：Bufffer Iml=1:10），在捣碎机中捣碎成匀浆。2将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4下，10000g，离心15min，将上清和沉淀分开。3 上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）4 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Bufffer I，重悬沉淀，在4下，10000g，离心15min， 取沉淀。5 重复操作4一次。6 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Buffer II，重悬沉淀，再次用组织捣碎机进行捣碎。7 将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4下，10000g，离心15min，将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液（留样（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）（二）蛋白含量测定（紫外吸收法）取适量的样品提取液（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液），根据蛋白质浓度，用Buffer I适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280 nm和260 nm波长下读取吸光度，以Buffer I为空白调零。结果计算： 蛋白质浓度= n （1.45 A2800.74 A260）（mgmL）式中：l.45和0.74为校正值；A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；A260为蛋白质溶液在260nm处的吸光度；n为稀释倍数。 （三）蛋白提取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1 聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶(10%)的配制（10ml）： ddH2O 4.0 ml 30%储备胶 3.3 ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml 10% AP 0.1 mlTEMED 4 l 混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30-60min）。（2）积层胶的配制（5ml）： ddH2O 3.4 ml 30%储备胶 0.83 ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.63 ml 10%SDS 0.05 ml 10%AP 0.05 ml TEMED 5 l 将分离胶上的水倒去,加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间（完全聚合需15-30mim）。2样品处理：将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的2SDS上样缓冲液，100加热5min，离心12000g1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS分子量蛋白标准品作平行处理。3 上样：分别取10l处理后的样品加入样品池中，并加入6l蛋白标准品作对照。4 电泳：在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚开始电压控制在90V，当样品到达分离胶后，可将电压调至180V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。5 染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。6 脱色；将胶从染色液中取出,放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰。7 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，并利用系统软件分析实验结果，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。（四）蛋白提取液的Western blotting鉴定1. 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白利用12%SDS-PAGE电泳分离。2. 用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。1） 将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。2） 裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。3） 裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。4） 按0.5 mA/cm2膜恒流电转移3050 min。（3）杂交a. 将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。b. TBST漂洗3 10 minc. 转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗MBSP多克隆抗体）中，室温反应1 hr。d. TBST漂洗3 10 mine. 转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG二抗工作液中，室温反应1 hr。f. TBST漂洗3 10 min。（4）显色将膜浸泡在DAB显色液中，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。（5）拍照和保存结果。附：溶液配制电转移缓冲液 48 mmol/L Tris 39 mmol/L 甘氨酸 0.01% SDS 20% 甲醇TBST20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.50.15 mol/L NaCl0.05% Tween-20Western blot封闭液：TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白抗体稀释液：TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白DAB显色液：二氧基联苯胺，Diaminobenzidine五、注意事项1进行高速离心时，两个对称的离心管的重量一定要相等，离心前一定要进行平衡。2蛋白含量测定时，吸光度值最好在1.0之内，否则需对样品进行稀释。3为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。4. 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。5. 在进行Western blotting鉴定时，蛋白Marker 要用预染Marker。6. 在进行Western blotting鉴定时，转膜方向要正确：凝胶在阴极，膜在阳极。六、 结果分析1. 分别计算每种鱼中水溶性蛋白和盐溶性蛋白的收率。2. 根据每个蛋白提取液的总蛋白含量，比较不同鱼类肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3. 根据电泳结果，分析淡水鱼和淡水鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4. 根据Western blotting鉴定结果，分析鱼类MBSP在鱼肉中的存在形式。 由图可知，盐溶性蛋白含量少且成分较少，在35KDa和45KDa之间，有两条明显的条带。而水溶性蛋白含量多且成分复杂，在35KDa和45KDa之间也有两条与盐溶性蛋白同样大小的蛋白条带。此外，海水鱼和淡水鱼的蛋白条