阳离子脂质体复合物与脂质!鱼精蛋白.pdf

阳离子脂质体 复合物与脂质 鱼精蛋白 复合物体外细胞转染率比较 孙逊 3 A 0 B用凝胶阻滞实验 确定阳离子脂质体与质粒0 12的配 比B用透射电镜观察阳离子脂质体 0 12复合物和3 A 0的形态 用激光粒度仪测定它们的粒径和C 5 I 肝癌细胞的转染率J结果表明阳离子脂质体 0 12复合物和3 A 0的形 态均近似于球体 但3 A 0的粒径明显较小B 3 A 0对张氏 D E F 肝细胞和H 5 I 肝癌细胞的转染率均高于阳离子 脂质体 0 12复合物J3 A 0是基因治疗的临床应用中一种更具前景的载体系统J 关键词阳离子脂质体 0 12复合物脂质 鱼精蛋白 0 12复合物转染率 K L M N O P Q R S T U NV P P T R T Q N R WX U YZ M L T O U NU P X M S T U N T R T Z U O U YQ X U YZ Q Q O M N T Z T L U S M YT N Q X U YZ Q Q O ab c d e f g h Ni h N j K T M N T N k l T Qm h j n o M N kn o T L U N k j hp T M U j qQ T m h r h M N l 0 4 7 7 7 15 7 67 0 0 22 3 0 4A 5 0 12 7 15 8 68 4 5 4 6 5 7 8 9 6 0 7 0 17 8 6 0 5 8 9 9I 8 0 0 6 15 8 7 9 6 8 5 5 0 7 5 0 4 0 4 7 7 70 12 7 8 4 5 7 7 1 0 12 7 15 8 9 E 17 0 5 E 7 8 7 F 97 3 A 0 68 4 5 7 7 1 0 12 7 15 8 6 7 0 8 6 9 8 6 4 1 0 6 7 0 E 0 F 7 3 A 0 6 8 4 5 7 7 1 0 12 7 15 8 6 0 1 7 0 6 9 5 E 7 8 0 7 7 5 9 A D 4 0 4 4 4 4 D E F 8 8 6H 5 I 8 8 6 0 8 8 7 6 9 F 8 9 4 9 6 7 7 6 E 0 12 7 15 8 E 6 0 F 7 8 0 5 E 0 4 8 7 0 9H7 6 8 0 7 15 0 6 64 0 12 7 15 8 3 A 0 E 60 0 1 8 8 05 0 4 C 617 EE 4 F E 0 4 4 94 D E F 8 8 6H 5 I 8 8 y z y v 93 A 0 7 7 8 6 5 0 5 0 6 4 8 964 E 1 8 8 5 0 4 C 6E 4 F E 4 7 4 8 4 93 A 01 9 F 7 7 6 7 8 4 0 8 F 6 8 4 8 0 98 E 4 8 7 0 5 5 8 4 6 8 4 8 0 9 9 Q WA U L OD 0 12 7 15 8 3 4 5 4 6 5 0 7 0 12 7 15 8 0 4 4 9 j 引言 基因治疗为一些长期困扰人类的重大疾病 如 恶性肿瘤G遗传病G感染性疾病的有效预防和治疗带 来了希望J伴随着基因治疗而出现的基因载体研究 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 B C计 划 资 助 项 目 C 22 4 8 E C 0 C C 8 F8 4 5 9 4 9 7 1 一直是突破其临床有效治疗的关键之一J目前 广泛 使用的基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载 体系统J非病毒载体系统因其具有使用方便G安全性 高G可大规模生产和无免疫原性等优点而备受关注 其中 阳离子脂质体 0 12复合物是目前研究得最 为广泛的非病毒载体系统G 质粒 A 5 B C D E 9 FA G D H I 9 8分析试剂盒 美国J G K A K B I D G公司 0鱼精蛋白硫 酸盐 二甲基双十八烷基溴化铵 D E 9 Y A Z D V 9 G B N S 英国P9 8 K D V G 0 7 1 S S S荧光分光光度计 日本岛津 0倒置显微镜 68 A F5 Y 日本 0 PB D 8 S酶标仪 美国伯乐 0 N X Q S S凝胶成相系统 水平凝胶电泳仪 美国法玛西 亚 2 3 2 质粒 a的扩增和纯化 质粒5 67 1 8 9 是 真核表达载体 包含 有报告基因8 9 其报告基因依赖M 1 Q b cd e杂 交启动子启动 采用f 3 g h i j菌株 c b扩增质粒 采 用M G B 1 V D D OA 9 I D GT A I 9试剂盒 分离纯化质粒 并 用紫外分光光度法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含 量进行了测定 纯度符合要求 2 3 k 阳离子脂质体l a复合物的制备 取一定量的 6 M和 质粒的 阳离子脂质体 8 A B C C DA E 8 F A C A G H A GF I C J K LML N O K P Q R P N S TS U V R P N S W N VX N Y S T S ZL TP S 0ML Q L1 2 4 4 1 5 6 1 Q L T Y L V P N L X 阳离子脂质体 复合物与 a 的形态 通过透射电镜观察 可见阳离子脂质体 C R 0X N Y S T S ZL 电 位 随着脂质与 比例的增加 脂质体 H A E 8 AA B i F 8 H C 8 l CA E 8 F A C A G H A GF 电位的影响 7 8 9th E E H A E 8 AA B i l F A B 8 A E 8 F A C A G H A GF 电位 为了考察鱼精蛋白对 的缩合能力 我们将 脂质与 的重量比固定为5 加入不同量的鱼精 蛋白 由图p可见 鱼精蛋白能更有效地缩合质粒 加入不同量的鱼精蛋白后 b 的粒径均显 图v鱼精蛋白与 的重量比对脂质体 复合物粒径的影响 7 8 9v h E E H A Ea A G8 B s 8 9 i 8 AA B i F 8 H C 8 l C A E a mw4 第4期孙逊等 阳离子脂质体 肝细胞和 0 A B3肝 癌细胞的转染能力均最强 而我们所制备的阳离子 脂质体 复合物对细胞的转染能力低于商品化 的阳离子脂质体 C A D E 0 F 1 2 C 0 见图G 当鱼精蛋白 与 的重量比为 肝 细胞和 0 A B3肝癌细胞的转染能力均最强 且当鱼 精蛋白与 的重量比为在 43之间时 对 细胞的转染能力均高于 C A D E 0 F 1 2 C 0 见图H 显而 易见 与阳离子脂质体 复合物相比 具 有更高的体外转染活性 图I脂质与J K L的重量比对脂质体M J K L复合物转染率的影响 N O P IQ R R S T UV RW O X O Y Z J K L S O P U U O V V U S U R S T U O V S R R O T O S T a V R W O X V V bS M J K L T V bX W S c S O d P Y eS X f g S X U V T a U S 图h鱼精蛋白与J K L的重量比对脂质体M J K L复合物转染率的影 响 N O PhQ R R S T UV Ri V U bO S Z J K L S O P U U O VV U SU R S T U O V S R R O T O S T aV R j i JO d P YeS X f g S X U V T a U S k 讨论 制备阳离子脂质体的阳性成分多为合成的双链 季铵盐型表面活性剂 其具有体外稳定性好l体内可 被生物降解的特点 但均具有一定的细胞毒性 我们 所 选 用 的 中 性 脂 质 成 分 二 油 酰 磷 脂 酰 乙 醇 胺 m n 具有很强的细胞膜去稳定化作用 可促进 脂质体与细胞膜的融合 提高复合物进入细胞内的 能力 从而提高转染率 在酸性条件下 m n可由 双层 o相转变为逆转的六角形相 又称 p相 其 辅助转染活性更为明显q r 0 1 2电位是微粒类给药系统的一个重要参数 通过 0 1 2电位的测定可以确定微粒的表面特征 了 解微粒的结构组成 还可判断微粒系统在溶液中的 稳定性q G r 在阳离子脂质体 复合物的制备中 当脂质与 的重量比为G时 其 0 1 2电位为s 7 5 近于中性 表明该复合物微粒间的相互排斥力 较小 受范得华力的作用 粒子间容易相互聚集 所 以该复合物的粒径较大 s t s 肝细胞和 0 A B3 肝癌细胞的转染实验中 我们也发现当脂质与 的重量比为3 9时 其转染率最高 由于阳离子聚合物的加入 能更有效地缩 合 所以 比阳离子脂质体 复合物的 粒径更小 此外 阳离子聚合物还可从以下几个方面 可提高转染率u首先 聚阳离子能够增加由内吞途径 产生的内化作用v其次 阳离子聚合物能够保护 对抗核酸酶的作用v 第三 阳离子聚合物还能 够提高 向细胞核的转运q r 我们选择鱼精蛋白 硫酸盐为阳离子聚合物 因为它是由海洋鱼类提取 t 生 物 医 学 工 程 学 杂 志第3 ww w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w 卷 万方数据 得到的天然产物 它被美国 批准用于一种胰岛 素缓释制剂和中和术后病人过量的肝素 已有长期 的临床应用史 其抗原性弱 安全性好 2 3 9 3 9 5 5 2 5 A B CD 9 5 9 E 9 C A 9 E A 3 D 9 C AF 9 A G H H 1 I J K G L M1 N G 9 9F O P3 B 5 D 2 C B 4 9 4 B D 9 4 9 E B 5 2 5 QC R 2 2 9 9 5 4 B R R 9 E R 2 C C 5 9 Q 2 5 E 9 5 9 E S 2 4 3 2 Q 9 C C R 9 Q S Q D 9 5 9 4 B 5 S 9 OT 2 C 6 U 9 1 J G N 1 K 1 I L M I 1 G H H G 9 3 6 a B7 Y Z 8 4 9 QD 9 5 9 4 U 9 B R 5U 3 B 5 9 5 2 D B S 4 4 3 2 2 E 9 C b C R 2 2 B C E 9 C A 9 2 S 4 U 9c d FD 9 5 9 6 B 5 Q 9 F 9 9 B Q U G H H G J G K 1 1 L MJ N 1 G e8 3 E B Q XO O f 3 27 V g B X 7 Y Z 5 2 A 9 C R P 9 5 4 A 9 C R 2 2 9S 2 3 C B 4 2 5Q 2 5 4 B 5 5 D2 C 9 C B C Q 2 U 2 C T 2 Q U T 2 R U Q 4 B G H H G 1 e J I M EC R 2 R 2 C R C 9 9 4 2U 9 R B 4 2 Q 4 9B 5 EP9 R B 4 2 B Q 9 C C 72 C EOf B 4 2 9 5 4 9 2 C 2 D G H H I 1 H K I L Me Q B C Q U B B Q 4 9 B 4 2 5B 5 E4 B 5 S 9 Q 4 2 59 S S Q 9 5 Q 2 SC R E b B 9 ED 9 5 9 E 9 C A 9 Q 2 R C 9 9 d 5 4 9 5 B 4 2 5 B CO U B B Q 9 3 4 Q 1 1 5 9 K LQ 2 R C 9 9 S 2 5 4 B A 9 5 2 3 D 9 5 9E 9 C A 9 f 9 5 9V U 9 B R 1 e K L M 9 E B 4 9 E D 9 5 9E 9 C A 9 4 2 4 U 9C A 9 b R 2 4 B 5 9 9 5 U B 5 Q 9 E B B C 2 S 9 4 3 5 C R 2 R