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检验操作讲义2011年08月17日第一部分钠盐鉴别操作规程一、目的：为确保钠盐鉴别的正确操作，并取得可靠的分析结果，特制订本检验操作规程。二、范围：适用于含钠的化合物鉴别。三、责任人：化验员、质量检查员。四、内容：1方法：1.1取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，在无色火焰中燃烧，火焰即显鲜黄色。1.2取供试品约100mg，置10ml试管中，加水2ml溶解，加15%碳酸钾溶液2ml，加热至沸腾，应不得有沉淀生成；加焦锑酸钾溶液4ml，置冰水中冷却，必要时，用玻棒摩擦试管内壁，应有致密的沉淀生成。2仪器：所有仪器要求洁净，以免干扰反应。3试药与试液：3.1试药应符合现行版药典要求，使用时应研成粉未。3.2 试液除另有规定外，均应按现行版药典附录试液项下的方法配制和贮藏。4注意事项：4.1在进行测试前，应将铂丝烧红，趁热浸入盐酸中，如此反复处理，直至火焰不现砖红色，再蘸试样进行试验，并只有当强烈的砖红火焰持续数秒钟不退，才能确认为正反应。5编制依据：中国药典2010年版二部第二部分氯 化 物 鉴 别 操 作 规 程一、目的：为确保氯化物鉴别的正确操作，并取得可靠的分析结果，特制订本检验操作规程。二、范围：适用于含氯的化合物鉴别。三、责任人：化验员、质量检查员。四、内容：1方法：1.1取供试品溶液，加稀硝酸使成酸性后，滴加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀；分离，沉淀加氨试液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀复生成。如供试品为生物碱或其它有机碱的盐酸盐，须先加氨试液使成碱性，将析出的沉淀滤过除去，取滤液进行试验。1.2取供试品少量，置试管中，加等量的二氧化锰，混匀，加硫酸湿润，缓缓加热，即发生氯气，能使用水湿润的碘化钾淀粉试纸显蓝色。2仪器：所有仪器要求洁净，以免干扰反应。3试药与试液：3.1试药应符合现行版药典要求，使用时应研成粉未。3.2试液除另有规定外，均应按现行版药典附录试液项下的方法配制和贮藏。4注意事项：4.1供试品和供试液的取用量应按各药品项下的规定，固体供试品就研成细粉。4.2试药和试液的加入量、方法和顺序应按4.1规定，不可任意改变或将秩序颠倒。4.3碘化钾淀粉试纸要求新鲜制备。第三部分紫 外 分 光 光 度 法 检 验 操 作 规 程一、目的：为确保紫外分光光度法的正确操作，并取得准确的分析结果，特制订本检验操作规程。二、范围：适用于所有需用紫外分光光度法分析的药品鉴别、检查和含量测定。三、责任人：化验员、质量检查员。四、内容：1紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。2仪器的检定：是对波长准确度和吸收度准确度的检定。2.1波长准确度检定：按756MC仪器的波长自动校正功能检定。2.2吸收度准确度检定：用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120干燥至恒重的基准重铬酸钾酸钾约60mg，精密称定，用0.005mo1/L硫酸溶液溶解并稀释至1000m1，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合表中的规定。波长/nm235（最小）257（最大）313（最小）350（最大）吸收系数（E1cm1%的规定值吸收系数（E1cm1%的许可范围124.5123.0126.0144.0142.8146.248.647.050.3106.6105.5108.52.3杂散光的检查 可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中规定。试剂浓度/%（g/m1）测定用波长/nm透光率/%碘化钠亚硝酸钠1.005.002203400.80.83样品测定操作方法：3.1吸收系数测定：按各药品项下规定的方法，配制供试品溶液，在规定的波长2nm测定其吸收度，并计算吸收系数，应符合规定范围。计算公式：AECLlg1/TA：吸收度 E：吸收系数，物理意义为当溶液浓度为1（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度C：供试品浓度，为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计）,gL：液层厚度，cm3.2鉴别及检查：测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白，按照该品种项下的规定测定供试品溶液在有关波长处的最大及最小吸收，应在规定波长的2nm以内。3.3含量测定：3.3.1对照品比较法：按各药品项下规定的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分应为供试品溶液中被测成分标示量的10010%以内，用同一溶剂在规定的波长分别测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度，并计算其含量。 A样W对S对计算公式：供试品含量%= 100% A对W样S样 A样、A对：样品、对照品吸收值 W样、W对：样品、对照品重量S样、S对：样品、对照品稀释倍数3.3.2吸收系数法：按照该品种项下配制供试品溶液，在规定波长及该波长2nm处测定吸收度，按照该品种在规定条件下给出的吸收系数计算含量。E1cm( (样) A样计算公式：供试品含量%= 100% = 100%E1cm( (标准) E1cm( (标准) CL 1% A样：样品吸收值 C：100ml溶液中所含溶液的克数 L：吸收池光路长度 E1cm (标准)：药典或药品标准中规定的百分吸收系数4.4注意事项：4.1试验中所用的量瓶、移液管均应校正、洗净后使用。4.2使用的石英比色皿必须洁净，一般用重铬酸钾溶液稍加浸泡，然后用水冲洗干净，晾干防尘保存。4.3使用的石英比色皿必须配对（即装入同一溶剂在规定波长处测定其透光率，相差在0.3%以下可配对使用，否则必须加以校正）。4.4取石英比色皿时，手指拿毛玻璃面的两侧，装盛样品溶液以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液应加盖，透光面在用擦镜纸由上而下擦拭干净，吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。4.5测定前，应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要求，可用英比色皿盛溶剂经空气为空白测定其吸收度，应符合下表规定。波长范围220-240241-250251-300300以上吸收度0.40.20.10.05每次测定时应采用同一厂牌批号、混合均匀的1批溶剂4.6称量应按药典要求，配制测定溶液时， 稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml，含量测定供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照相品一般也应称取2份，吸收系数检查也应称取二份平行操作，每份结果对平均值的偏差应在0.8%以内，作鉴别或检查可取样品1份。4.7供试品测试溶液的浓度，除该品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸收度应在0.3-0.7为宜。4.8测定时除另有规定外，应在规定的吸收峰2nm处，再测几点的吸收度，以核公款供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸收度最大的波长作为测定波长，除另有规定外，吸收度最大波长应在该品种项下规定波长的1nm以内。第四部分薄 层 色 谙 法 检 验 操 作 规 程一、目 的：建立本方法，规范薄层色谱检验操作，保障检验的规范性、准确性。二、适用范围：适用于对样品的鉴别、杂质检查和含量测定。三、责 任 者：QC检验员对本检验方法的负责，中心化验室主任负责监督实施。四、内 容1 仪器与材料1.1 玻板 除另有规定外，用10cm10cm，10cm15cm，20cm10cm或20cm20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。1.2 吸附剂或载体 常见的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。1.3 涂布器 使吸附剂或载体在玻璃板上手工或自动涂成一层符合要求的均匀薄层。1.4 点样器一般采用微升毛细管、微型注射器或与之相适应的点样器材。1.5 展开室 可用适合薄层析大小的专用玻璃缸，底部平底或有双槽，盖子须密闭。2 薄层板制备2.1 加粘合剂薄层板的制备2.1.1 薄层板制备 首先选择薄层板，要求玻板平整、光滑，洗净后不附水珠。根据标准需要，称取市售硅胶，（要求颗粒大小均匀，一般粒径在10-40m）的硅胶G30g、或硅胶GF254或硅胶H等硅胶30g，加水6090ml在研钵中向一方向研磨混合，调制成糊状后立即均匀涂布在玻璃板上，如发现有气泡，可滴加数滴乙醇，这样可防止气泡产生。2.1.2 取羧甲基纤维素钠（CMC-Na）0.20.5g溶于100ml水中，（必要时可加热煮沸直至溶解，冷却至室温）取上清液，取过200250目的硅胶50g，（需置荧光下检视的不能过筛），用0.2%0.5的CMC-Na滤过液调制成糊状。2.1.3 制备方法2.1.3.1 倾斜涂布法：取适当量的薄层糊放在玻璃缸的一端，使之倾斜后，用一根玻璃棒从顶端将薄层糊徐徐引向下方，然后放在水平桌面上敲击使之均匀即成。2.1.3.2 平铺法：在水平玻璃台面上，放上2mm厚的玻璃板，二边用3mm厚的长条玻璃做边，根据所需薄层的厚度，可在中间的玻璃板下面垫塑料薄膜。然后将薄层糊倒在中间玻璃板上，用一块具有光滑及平直边的玻璃板的一边，由一端向另一端作较快地均匀地一次将吸附剂糊刮平，使成一薄层，然后去掉两边的玻板，轻轻振动薄层板，即得均匀、厚度一致薄层，任其自然干燥，经活化之后使用。也可用专门涂铺器涂铺，所铺薄层的厚度为0.250.5mm，在室温下，置水平台上晾干，在反射光及透射光下检视，表面应均匀、平整，无麻点，无气泡、无破损及污染。2.2 不加粘合剂薄层板制备取吸附剂或载体用水适量调成糊状，按2.1.3操作。2.3 薄层板的活化把晾干后的薄层板，小心地放入烘箱中，于110烘30分钟，冷却后立即使用或贮存于变色硅胶干燥剂的干燥器中备用，或用商品预制板。 3 点样3.1 除另有规定外,在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器点样于薄层板上，一般为 圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边1015mm，高效板一般基线离底边810mm。圆点状直径一般不大于3mm，高效板一般大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为510mm。高效板条带宽度一般为48mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。必须注意勿损坏薄层表面。4 展开4.1将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开815cm，高效薄层板上展开58cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄 层板，晾干，待检测。4.2展开前应先将适量展开剂置层析缸内，密闭，进行饱和。一般保持1530分钟。然后迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。必要时，可进行二次展开或双向展开。展开至规定位置后，取出，晾干。5 检测5.1 定性检查供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光下观察荧光色谱。5.1.2 根据样品的Rf值与标准品的Rf对照比较进行定性鉴别，Rf计算公式如下：5.2 定量检测 5.2.1 目视测定法在同一块薄板上，滴加不同量的标准品作成系列，再在其旁滴加供试品。展开后目视色斑的颜色深浅和面积大小，求出未知样品含量的近似值，计算公式如下： V0V2S1000供试品含量（g）= WV1V3W：取样品的重量（g） V0：提取时加入的提取液体积（ml） V1：净化时吸取的提取液体积（ml）V2：净化后浓缩定量的体积（ml） S：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量的mg数5.2.2 斑点面积定量法 在同一块薄板上滴加三个样品，一个为标准溶液，一个是经适量稀释的标准溶液，另一个为样品溶液，展开后，用一张半透明的绘图纸覆盖在薄层上，找出斑点的面积，移至坐标纸上读出斑点所点的格数。计算公式如下：A：样品斑点面积 As：标准品斑点面积Asd：稀释后标准品的斑点面积 d：稀释倍数的倒数Ws：标准品的重量（mg） W：样品的重量（mg）5.3 如需要，可用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接对斑点作扫描用于鉴别、杂质检查定量。6 结果判定6.1 可用样品Rf值与标准品Rf值判定样品纯杂程度。6.2 用薄层扫描法得到图谱及积分数据进行分析后，可用于样品的鉴别、杂质检查或含量测定。7 注意事项7.1 点样时避免在薄板上造成洞穴，否则会使分离点出现三角形的区带，影响分离效果。7.2 加粘合剂的薄板制备完成后要刮去两边缘的残留物避免产生边缘效应。7.3 目视定量法只适用于半定量。8 编制依据中国药典2010年版。第五部分高 效 液 相 色 谙 法 检 验 操 作 规 程一、目 的：建立在高效液相色谱仪上进行分离的药品的分析测定，特别是多组份测定、杂质检查和大分子物质的测定。二、适用范围：适用于药物成份能在色谱柱上进行有效分离物质的测定。三、责 任 者：QC检验员对本检验方法的负责，中心化验室主任负责监督实施。四、内 容：1 高效液相色谱仪的使用要求1.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。1.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。1.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。2 操作前的准备2.1 流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求。水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45mm适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相待用。2.2 供试液的配制供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时，对照溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45mm滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染或对色谱干扰。 2.3 检查上次使用记录和仪器状态，检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶。流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。3 操作3.1 泵的操作3.1.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，接通电源，启动泵。PURGE3.1.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（如9ml/min）或用冲洗键 进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或待其自动停止STOP冲洗，关闭排放阀。3.1.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定。用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连续处应无渗漏。初平衡时间一般约需30分钟。如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始比例的流动相对色谱柱进行平衡。3.2 紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。3.2.1 开启检测器电源开关，选择并开启光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，待稳定后，测试参比和样品光路的信号应符合要求，设置吸收度方式和检测响应时间（一般不大于1秒），设置满刻度吸收值适用于记录仪。3.2.2 开启色谱处理机，设置处理方法，初步设定衰减、纸速、记录时间、最小峰面积等参数，或设定记录仪的约速和衰减。3.2.3 进行检测器回零操作，检查处理机的电平LEVEL，应符合要求，或检查记录仪的笔处在设定的起始位置，如有变动，可继续回零操作直至符合要求。3.2.4 记录基线，待稳定后，进行处理机斜率测试，符合要求后方能进行操作。3.3 进样操作六通阀式进样器3.3.1 把进样器手柄放在载样位置（LOAD）。3.3.2 用供试溶液清洗配套的注射器，再抽取适量，如用定量环（LOOP）载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的5倍，用微量注射器定容进样时，进样量不得多于环容积的50%。在排除气泡后方能向进样器中注入供试溶液。3.3.3 把注射器的平头针直插至进样器的底部，注入供试溶液，除另有规定外，注射器不应取下。3.3.4 把手柄转至注样位置（INJECT），定量环内供试溶液即被流动相带入流路。3.4 色谱数据的收集和处理。3.4.1 注样的同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如系记录仪，同注样同时按一下记号键作起始记号。3.4.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。3.4.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整衰减、纸速、记录时间等参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。定量测定中，一般峰顶不得超过记录满量程。再按（3.3.13.1）进行正式分析操作。如果要用处理机进行运算，还可按第一张图的色谱的参数，参照说明书，对参与运算的色谱峰进行鉴别操作，然后进行正式分析操作。3.4.4 含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次，由全部注样结果（n4）求得平均值，相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。3.4.5 色谱系统适用性试验应符合中国药典的要求，如按指定峰计算的理论板数（n）和拖尾因子（T），以及相邻峰之间的分离度（R）。计算公式如下：n=5.54 tR (Wh/2)2 n：理论塔板数 tR：保留时间 Wh/2：半高峰宽T=W0.05/2d1 T：拖尾因子(一般为0.251.05之间) W0.05：为离基线5%峰高处的峰宽d1：峰上升边离5%峰高处的距离R=2（tR2-tR1）/(W1+W2)=1.18（tR2-tR1）/(W+W)R：两峰之间的分离度。TR1：相邻二峰的前一峰的保留时间。TR2：相邻二峰的后一峰的保留时间。W1：相邻二峰的前一峰的底宽。W2：相邻二峰的后一峰的底宽。W：相邻二峰的前一峰的半高峰宽。W：相邻二峰的后一峰的半高峰宽。3.5 清洗和关机3.5.1 分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水，然后用甲醇-水冲洗，冲洗前先按（3.1.13.1.2）操作，再用分析流速冲洗，各冲洗溶剂一般冲洗1530min，特殊情况应延长冲洗时间。3.5.2 冲洗完毕后逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。3.5.3 关闭电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。4 测定结果处理4.1峰面积归一法：按药品标准有关项下进行峰面积归一法求组分含量的按下式计算：百分含量C%Ai/A100%其中Ai为被测含量组分锋面积。A为参与计算的全部峰面积溶剂峰和其它干扰峰除外之和。采用本法时，应考虑1最小组分和最大组分的检测响应是否在线性范围内。2在所用检测波长下各组分响应的差别。4.2 内标法4.2.1 用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正因子f：fAs/ms/AR/mRf：校正因子AS：内标物质峰高或峰面积AR：对照品的峰高或峰面积mS：为加入内标物质的量mR：为加入对照品的量4.2.2 再根据含内标物质的供试品溶液色谱峰响应值，计算含量mi： mifAi/Ax/msAi：供试品的峰高或峰面积Ax为内标物质的峰面积或峰高ms为加入内标物质的量，必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示析算成为标示量的百分含量，或稀释倍数和取样量折算成百分含量。4.3 外标法:用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算比值r：rmr/Ar其中：mr和Ar分别为对照品的量和相应的峰面积或峰高。再根据供试品溶液的色谱峰响应值，计算供试品中被测成份的含量mi:mirAi其中：Ai为供试品溶液中被测溶液的峰面积或峰高，必要时，再根据稀释倍数，取样量和标示量折算成标示量的百分含量，或根据稀释倍数，取样量折算成百分含量。4.4 杂质检查法：按药品标准规定的方法测定杂质的含量或限量时，如杂质对照品已经建立，则可安规定用上述标法或外标法进行测定。如杂质对照品没有建立无法获得，或杂质未知，则可按下法测定，当供试溶液的溶剂干扰供试品溶液的测定时，应取等体积溶剂进样，并将溶剂的背景色谱响应，从供试品溶液的色谱响应中扣除。4.4.1 加校正因子的主成分自身对照法：在已知杂质在规定检测波长下的吸收系数与主成分的一致的情况下，在建立方法时，可精密称量取经精制的杂质和主成分对照品各适量，分别配制成溶液，精密各溶液配制测定杂质校正因子的溶液，记录色谱图，按内标法以主成分为内标计算杂质的校正因子。此校正因子记载在质量标准的含量测定项下，用于校正杂质的峰面积，再按照的方法计算杂质的含量，由于没有杂质对照品，含量测定项下正应规定这类杂质峰的位置，最好用相对于主成分的相对保留时间表示。4.4.2 不加校正因子的主成分自身对照法：在杂质未知或未建立杂质对照品的情况下，药品标准可用不加校正因子的主自身对照法测定杂质的含量或限量，在测定前，先按各项品种项下规定的杂质限度，将供品溶液稀释成相应深度的对照溶液，该对照溶液的主成分色谱峰应具有足够的响应，以便进行计算。并调节检测器的灵敏度或色谱记录参数，使对照溶液主成分色谱峰应具有足够的响应，以便进行计算。并调节检测器的灵敏度或色谱记录参数，使对照溶液主成分色谱峰高达记录仪满标度的约1025%，或其积分值应能准确积