第四节 细胞相容性评价 2.ppt

材料的生物相容性评价 焦延jiaoyp QQ 10107667材料科学与工程系 第四节细胞相容性评价 2 1简介 细胞和生物材料的相互作用有两种主要的方式 特异性和非特异性的相互作用 非特异性的作用通常很难控制 因为这种相互作用所基于的性质对于多数细胞类型来讲是共同拥有的 这些性质包括细胞的表面性质 如细胞膜表面的负电荷性 细胞膜表面的亲脂性膜蛋白 和能够介导细胞在生物材料表面非特异性粘附的亲脂性细胞外基质蛋白 相反 特异性的相互作用更加容易控制 这是因为它们的相互作用是基于特定的化学和生物学结构 如能够和细胞表面受体结合的配体 生物仿生化 的和 生物活性 的材料能够控制这些精细的相互作用 2 2细胞相容性的评价方法 细胞生物相容性评价是生物材料生物相容性评价的一项重要内容 是指应用体外细胞培养的方法 通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性 细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段 具有简便 敏感性高 节省动物 节约经费 缩短生物材料研究周期等优点 目前几乎所有的生物材料都必须通过相关实验来检测其是否具有细胞毒性 已被广泛应用于生物相容性评价 在ISO10993 5标准中对试验的主要步骤 细胞株和细胞培养基 阴性和阳性对照都作了原则要求 并推荐了琼脂覆盖法和分子扩散法 即滤过法 近年来进一步发展细胞毒性试验 从形态学方法检测细胞损伤 细胞损伤测定 细胞生长测定和细胞代谢特性测定等角度提出了不少试验方法 并从定性评价逐渐向定量测定发展 一些常用的细胞毒性实验方法如下 一 细胞形态学评价 细胞形态学评价一种发展最早的定性细胞损伤检测方法 材料导致细胞损伤从而发生形态学的改变 通过显微镜下观察到变圆或裂解细胞所占的百分比来估算细胞毒性级别 目测该细胞毒性试验方无法定量细胞毒性大小 由于该方法可直观地观察到材料细胞毒性的大小 所以目前仍被广泛用于生物材料细胞毒性的评价 二 细胞膜完整性测定 生物材料对细胞的毒性作用也反映在细胞膜的变化中 细胞膜结构和功能的完整对于将细胞与其周围环境分离起重要作用 中性红摄取试验法 检测原理是未受损的细胞可摄取中性红染料并将其蓄积在溶酶体内 活细胞摄入中性红的水平与活细胞的数量成正比 乳酸脱氢酶释放法 LDH是一种存在于活细胞中稳定的胞质酶 其渗出增加提示细胞膜的稳定性遭到破坏 通过测定进入介质的LDH释放的渗透性能够检测细胞膜的完整性 进而反映细胞活性 三 细胞代谢活性评价 线粒体琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法应用最广泛 线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征之一 所以可以十分灵敏地反映出材料对细胞造成的毒性损害程度 MTT法是一种快速评定细胞毒性和细胞增殖的比色分析法 常用于细胞代谢和功能的测定 在MTT试验法的基础上发展了XTT试验法 XTT法实验时间短 步骤简便 目前已广泛用于生物材料的相容性评价 由于该法较MTT法具有明显的优点 已被纳入国际标准ISO10993 5 2009中 但实验成本较MTT法高 MTT法 XTT法 CCK 8法 四 细胞增殖率评价 观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖率的改变 主要有克隆形成试验 五 细胞增殖相关蛋白检测 六 细胞周期的检测 综上所述 评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多 亦各有其特点 各试验方法之间虽然存在一定的相关性 但是很难达到完全一致性 因此在选择试验方法时 必须根据 最接近应用状况 的原则 合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价指标或评价方法 综合运用分子水平评价方法 阐明材料对细胞的作用机制 全面地评价生物材料对细胞的毒性作用 将是生物材料细胞生物相容性评价的发展方向 2 3细胞培养技术 司徒镇强 细胞培养 1 研究的对象是活细胞能长时间 直接观察 研究活细胞的形态 结构 生命活动等 2 3 1细胞培养的优点 2 研究条件可以人为控制选择对象 均一性 重复性 类型 性质 阶段 调节条件 化学 物理 生物等因素条件研究方法 各种研究技术 记录方法 3 研究的范围比较广泛学科多 细胞学 免疫学 肿瘤学 生物化学 遗传学 分子生物学等对象广 各种动物 低等动物 高等动物 人类一种动物 不同年龄 不同组织 正常或异常 肿瘤 4 研究的费用相对较经济可提供大量 同一时期 重复性好的 生物学性状相似的实验对象 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同 当细胞被置于体外培养后 生活在缺乏动态平衡的环境中久了 必然发生变化 1 与体内主要不同相对孤立 单一 缺乏体内的系统作用 失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2 主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不明显 细胞趋向单一化 2 3 2细胞培养的缺点 提示 对于体外培养的细胞 应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状 结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体 而不能将之与体内的细胞完全等同 初代培养 原代培养 primaryculture 从直接取自生物体细胞 组织或器官开始的培养 初代培养物一旦进行传代培养后 就成为细胞系 通常10代以内的培养物用作原代培养 传代培养 sub culture 不论是否稀释 在体外培养条件下 将细胞从一个培养器皿转移至另一培养器皿 2 3 3常用术语 贴壁培养 anchorage dependentculture 细胞或培养物只有贴附于不起化学作用的物体 玻璃或塑料等无活性物体 的表面时才能生长 生存或维持功能 不能表明细胞属于正常或恶性转化 悬浮培养 suspensionculture 细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式 淋巴细胞 血液肿瘤细胞等 细胞株 cellstrain 通过筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的细胞 这些特性 有一定的标记染色体 特殊的抗原性等 在以后的培养中必须持续存在 亚株 substrain 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状有一定不同的细胞群 细胞凋亡 apoptosis 细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程 与机体正常发育 形态形成 消除多余细胞等生理过程密切相关 主要形态特征为细胞皱缩 染色质聚集与周边化 以及凋亡小体的形成 ATCC Americantypeculturecollection 美国模式培养物收集中心 美国菌种保藏中心 除收集细菌 病毒外 还保藏有大量的细胞株 系 体外转化 invitrotransformation 细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态 抗原 增殖或其它特性的可遗传的变化 但不具有致瘤性 汇合 confluence 在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层 细胞融合 cellfusion 在体外培养条件下 经化学试剂 PEG 病毒 灭活仙台病毒 或物理方法 电脉冲 诱发 使不同种的体细胞融合产生杂交细胞 细胞周期 cellcycle 细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程 DNA合成期 S期 有丝分裂期 M期 有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期 G1期 DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期 G2期 群体倍增时间 populationdoublingtime 在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间 细胞代时 cellgenerationtime 单个细胞两次连续分裂的时间间隔 群体密度 populationdensity 培养器皿内 每单位面积或体积中的细胞数 多用细胞数 cm2表示 接触抑制 contactinhibition 当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互接触时 便停止了分裂增殖 虽然相互紧密接触 但不形成交叉重叠生长 也不再进入S期 饱和密度 saturationdensity 在特定条件下 培养皿内能达到的最高细胞数 当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖 贴壁培养 细胞数 cm2 悬浮培养 细胞数 cm3 2 3 4常用设备和培养基 1 实验用品超净工作台 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱 滤器 酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪 微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器 纯水仪耗材 培养瓶 吸管 电动吸引器 培养板 冻存管 压力蒸汽消毒器 湿热消毒 用途广电热干燥箱 干热消毒 160 2小时 主要用干玻璃器皿消毒滤器 过滤除菌 大多数培养用液 如人工合成培养基 血清 酶液等均采用滤过法除菌超净工作台 为细胞操作提供无菌环境紫外灯 紫外线消毒 主要用于培养室空气 操作台 塑料培养皿和培养板等表面消毒 超净台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒 使空气得到净化 净化空气徐徐通过工作台面 使工作台内构成无菌环境 灭菌器 滤器 CO2培养箱 CO2培养箱设定的条件为37 5 CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题 用螺旋口瓶培养细胞时 需将瓶盖微松 以保证通气 保持培养箱内空气干净 定期消毒 90 14h 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度 避兔培养液蒸发 显微镜 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 微孔板震荡器 酶标仪 培养板 培养瓶 培养皿 移液管 移液枪 常用玻璃器皿清洗浸泡 自来水 刷洗 洗衣粉 酸泡 24小时 流水冲洗 蒸溜水浸泡和冲洗 50 烘干 36 塑料制品的清洗 塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的成品 打开包装即可用 多为一次性物品 必要时用 2 NaOH浸泡过夜自来水充分冲洗 洗洁精洗刷5 盐酸溶液浸泡30分钟自来水和蒸馏水冲洗 15 20遍 晾干备用 紫外线直接照射或辐照灭菌 37 橡胶制品的清洗 每次用后立即置入水中浸泡冲洗 2 NaOH或洗衣粉煮沸10 20分钟以除掉培养中的蛋白质 自来水冲洗 1 稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10 20分钟 晾干备用 注意 橡胶器材需用铝铂包装 放在铝盒内高压蒸汽灭菌 38 金属制品的清洗 洗涤剂刷洗流水冲洗去离子水浸泡24小时三蒸水浸泡24小时干燥备用 清洁液的配制 2细胞培养用液的配制水 新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液 无Ca2 Mg2 的缓冲液PBS NaCl8 0gKCl0 2gNa2HPO4 H2O1 56gKH2PO40 20g加水至1000ml 消化液 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键 除去细胞间粘蛋白及糖蛋白 影响细胞骨架 从而使细胞分离 胰蛋白酶液浓度越高 作用越强 但超过一定限度会损伤细胞 胰蛋白酶是一种黄白色粉末 用无Ca2 Mg2 的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0 25 用滤器过滤除菌 胰蛋白酶液消化时间 2 10分钟 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基 培养基 培养液 是维持体外细胞生存和生长的溶液 分天然培养基和合成培养基 天然培养基 天然培养基有血清 血浆 和组织提取液 如鸡胚和牛胚浸液 优点 营养成分丰富 培养效果好缺点 来源受限 成分复杂 影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析 易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量 用人工方法模拟合成的 目前已设计出许多种培养基 如TC199 MEM RPMI 1640 DMEM等 合成培养基主要成分是氨基酸 维生素 碳水化合物 无机盐和其它一些辅助物质 优点 标准化生产 组分和含量相对固定 本低缺点 缺少某些成分 不能完全满足体外细胞生长需要 人工合成培养基只能维持细胞生存 要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基 如血清 血清中含有 多种蛋白质 白蛋白 球蛋白 铁蛋白等 多种金属离子 激素 促贴附物质 如纤粘蛋白 冷析球蛋白 胶原等 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 一般说来 含5 小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死 但支持细胞生长一般需加10 血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明 但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清中不仅存在促细胞生长因子 同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子 因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应 在生长因子 蛋白质工程 基因表达调控等研究领域 迫切需要用无血清培养基培养细胞 无血清培养基的主要研制策略 在基础培养基中补充各种必需因子 如激素 生长因子 结合蛋白 贴壁和扩展因子等 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成 1975年 Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株 近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性 可重复性和稳定性 减少了细胞污染 简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序 向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的 适用于某种细胞株的培养液 很可能不适合另一种细胞株的生长 即使同源组织的不同细胞株 所需补加物也不同 无血清培养基尚处于研究阶段 难以推广 目前 绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 血清质量好坏是实验成败的关键 常用血清有胎牛血清 新生牛血清 小牛血清 兔血清 马血清等 其中以胎牛血清质量最好 优质血清的标准 透明 淡黄色 无沉淀物 无细菌 支原体 病毒污染 血清的灭活 消除补体活性 56 30分钟血清的消毒 过滤除菌 抗生素的使用 在培养液配制后 培养液内常加适量抗生素 以抑制可能存在的细菌的生长 通常是青霉素和链霉素联合使用 培养基内青霉素 链霉素最终使用浓度为每毫升100单位 庆大霉素 每毫升100单位 方便 广谱 稳定 50 2 3 5无菌操作 1 培养室和超净台的消毒消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置 否则会遮挡射线降低消毒效果 些操作用具如移液器 废液缸 污物盒 试管架等用75 酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒 2 洗手和着装进入无菌培养室原则上需彻底洗手并按外科手术要求着装 无菌服 帽子和口罩每次实验后 均需清洗 消毒 操作前要用75 酒精或0 2 新洁尔灭消毒手和前臂 51 3 无菌培养操作火焰消毒在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时 首先要点燃酒精灯 以后一切操作 如按装吸管帽 打开或封闭瓶口等 都在火焰近处并经过烧灼进行 操作时 动作要准确敏捷 但又不必太快 以防空气流动 增加污染机会 不能用手触及已消毒器皿 如已接触 要用火焰烧灼消毒或取备品更换 52 无菌培养操作工作台面上的用品要放置有序 布局合理 一般酒精灯位于中间 右手使用的在右侧 左手使用的在左侧 移液管 尖吸管不应交叉使用 防止交叉污染 2 3 6培养细胞的污染 不仅指微生物 而且包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物 包括微生物 细胞和化学物质 54 微生物污染的检测 微生物污染的种类可分成细菌 真菌 病毒和支原体 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源 严格之无菌操作技术 清洁的环境 与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法 55 细菌和真菌的污染和检测 肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法 真菌污染 培养液中形成白色或浅黄色漂浮物肉眼可见 短期内培养液不混浊镜下可见在细胞之间有综合交错穿行的丝状 管状及树枝状菌丝 并悬浮漂荡在培养液中 也可通过染色加以判断 56 细胞被霉菌污染的镜检图 细胞被白色念球菌污染的镜检图 细胞被真菌污染的镜检图 细胞污染的电镜照片 细菌污染 多为大肠杆菌 白色葡萄球菌 假单胞菌等污染污染后 培养基颜色短期变黄 出现浑浊镜下可见大量圆球状颗粒漂浮物 细胞生长停止并有中毒表现可通过革兰染色和肉汤接种加以鉴定多发生在接种的48h以内 59 60 支原体的污染和检测 支原体高污染率的原因 支原体最小直径0 2 m 无细胞壁 约有1 可透过滤菌器 0 22 0 45 m 支原体污染时 没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 过去缺乏简单 快速且可靠的检测方式 研究人员忽略污染问题 支原体的检测荧光染色法电镜检查DNA分子杂交检查或支原体培养 2 3 7细胞培养技术1 细胞的原代培养 是将机体内的某组织取出 分散成单细胞 在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法 借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖 细胞的接触抑制 细胞的衰老 死亡等生命现象 幼稚状态的组织和细胞 如动物的胚胎 幼仔的脏器等更容易进行原代培养 意义 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体 生物性状尚未发生很大变化 具有二倍体的遗传性 而且大多数细胞表现出原来组织的特性 利用原代培养做各种实验 药物测试 细胞分化及病毒学方面 效果很好 原代培养也是建立各种细胞系 株 必须经过的阶段 实验材料 实验动物 孕鼠或新生小鼠液体 细胞生长液 内含20 小牛血清 0 25 胰蛋白酶平衡盐溶液70 乙醇器材 灭菌镊子 剪刀 灭菌培养皿 细胞培养瓶 小瓶 烧杯 吸管 酒精灯 原代细胞培养方法 胰酶消化法组织块直接培养法 消化法 采用无菌操作的方法 把组织 或器官 从动物体内取出 经酶消化处理 使分散成单个细胞 然后在人工条件下培养 使其不断地生长和繁殖 贴块法 消化法 原代培养方法分类 分次消化 消化法的分类 组织块培养步骤图解 操作步骤1 取材 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡 把整个孕鼠浸入盛有75 乙醇的烧杯中数秒钟消毒 取出后放在大平皿中携入超净台 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口 用无菌镊子将皮肤扯向后腿 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部 取出含有胚胎的子宫 置于无菌的培养皿上 剔除胚胎周围的包膜 若胚胎较大 应剪去头 爪 将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中 漂洗胚胎 去掉平衡盐溶液 继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止 操作步骤2 切割 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中 用平衡盐溶液漂洗 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎 直到成1mm3左右的小块 再用平衡盐溶液清洗 洗到组织块发白为止 静置 使组织块自然沉淀到管底 弃上清 胰酶消化法操作步骤 消化 接种培养 视组织块量加入5 6倍的0 25 胰酶液 37 中消化20 40min 每隔5min振荡一次 或用吸管吹打一次 使细胞分离 加入3 5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用 或加入胰酶抑制剂 静置5 10min 使未分散的组织块下沉 取悬液加入到离心管中 1000rpm 离心5 10min 弃上清液 加入平衡盐溶液5ml 冲散细胞 再离心一次 弃上清液 加入细胞生长液l 2ml 视细胞量 血球计数板计数 将细胞调整到5 105 ml左右 转移至25ml细胞培养瓶中 37 下培养 胰酶消化法操作步骤 消化 接种培养 也可将此步骤简化为 视组织块量加入5 6倍的0 25 胰酶液 37 中消化20 40min 每隔5min振荡一次 静置 吸去上清 用细胞生长液漂洗消化后的组织块 用吸管反复吹打组织块 使细胞分离 静置 使未分散的组织块下沉 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中 调整细胞浓度到5 105 ml左右 37 下培养 注意 省略了离心 计数等步骤 组织块直接培养法操作步骤 组织块接种 将组织块转移到培养瓶 贴附于瓶底面 翻转瓶底朝上 将细胞生长液加至瓶中 培养液勿接触组织块 37 静置3 5h 轻轻翻转培养瓶 使组织浸入细胞生长液中 勿使组织漂起 37 继续培养 原代细胞培养结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁 并开始生长如接种的细胞密度适宜 5 7d即可形成单层 2传代细胞培养 细胞 一代 指从细胞接种到分离再培养的一段期间 与细胞世代或倍增不同 在一代中 细胞培增3 6次培养的细胞形成单层汇合以后 由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭 将培养的细胞分散 从容器中取出 以1 2或1 3以上的比率转移到新的容器中进行培养 即为传代培养 也是一种将细胞种保存下去的方法 同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程 悬浮型细胞直接分瓶就可以 而贴壁细胞需经消化后才能分瓶 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点 传代方法有3种 1 悬浮生长细胞传代离心法传代 离心 1000转 分 去上清 沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法 悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后 将上清培养液去除1 2 2 3 然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代 2 半悬浮生长细胞传代 HeLa细胞 此类细胞部分呈现贴壁生长现象 但贴壁不牢 可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来 进行传代 3 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代 常用消化液是0 25 胰蛋白酶液 消化法传代培养步骤 选取生长良好的细胞 在超净工作台的酒精灯旁 倒去瓶中的旧培养液 加入2 3ml的D Hanks液 轻轻振荡漂洗细胞 以除去悬浮在细胞表面的碎片 加入适量0 1 0 25 胰蛋白酶消化液 室温消化 倒置显微镜下观察 待细胞单层收缩突起出现空隙时 倒去酶液用Hanks液洗涤1次 加入适量培养液 反复吹打细胞 使其成细胞悬液 以1 2或1 3进行分装 并在培养瓶上做好标记 注明代号 日期 轻轻摇匀 37 CO2培养箱培养 观察 细胞培养24h后 即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况 贴壁生长细胞传代方法 3培养细胞生长测定 是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成 从形态上区别死 活细胞是困难的 方法 细胞计数法台盼蓝染色法生长曲线法四唑盐 MTT 比色法 细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法 血细胞计数板人工计数细胞计数器血细胞计数板 常用的是改良的纽巴氏 Neubauer 血细胞计数板 实验原理 血球计数盘一般有二个chambers 每个chamber中细刻9个1mm2大正方形 其中4个角落之正方形再细刻16个小格 深度均为0 1mm 当chamber上方盖上盖玻片后 每个大正方形之体积为1mm2 0 1mm 1 0 10 4ml 使用时 计数每个大正方形内之细胞数目 乘以稀释倍数 再乘以104 即为每ml中之细胞数目 存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色 而活细胞因细胞膜完整 染料无法渗入而不会呈色 具体操作 1 将计数板及盖片用75 酒精擦拭干净 并将盖片盖在计数板 2 吸取少许混合均匀的细胞悬液 滴加在盖片边缘 使悬液充满盖片和计数板之间 静置3min 注意盖片下不要有气泡 也不能让悬液流入旁边槽中 3 计算板四大格细胞总数 压线细胞只计左侧和上方的 然后按公式计算 细胞数 mL 四大格细胞总数 4 104 稀释倍数 注意 镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团 应按单个细胞计算 若细胞团10 以上 说明分散不好 需重新制备细胞悬液 104个 ml 由于死细胞的细胞膜通透性发生改变 某些染料可大量进入却不被排出 因而细胞呈色 而活细胞反之 能排出进入细胞内的染料 因而不易着色 此法的原理即是利用死 活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞 台盼蓝染细胞时 时间不宜过长 约2min 台盼蓝排除检测法 将1滴细胞悬液 贴壁细胞可经0 25 胰蛋白酶溶液消化后 吹打制成细胞悬液 与2滴台盼蓝液混合后 滴入细胞计数板 2min后 在显微镜下计数至少200个细胞 未着色的为活细胞 呈蓝色的为死细胞 计算活细胞百分比 活体染色与细胞计数 细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线 cellgrowthcurve 是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标 可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度 确定细胞传代 细胞冻存或具体实验的最佳时间 它以培养时间为横坐标 细胞密度为纵坐标作坐标图 1 培养细胞首先在2 孔培养板内分别接种相同数量的细胞 计数并记录接种的细胞悬液之密度 接种时间记为0h 2 计数细胞密度从接种时间算起 每隔24h计数 孔内的细胞密度 算出平均值 为提高准确率 对每孔细胞可计数2 3次 如此操作至第七天结束 3 绘制曲线以培养时间为横坐标 细胞密度为纵坐标 将全部结果在坐标纸上绘图 即得所培养细胞的生长曲线 四唑盐 MTT 商品名为噻唑蓝四唑盐比色法的原理 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物 formazan 并沉淀在细胞中 而死细胞没有这种功能 二甲亚砜 DMSO 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比 用酶标仪测定OD570nm值 MTT法简单快速 准确 广泛应用于新药筛选 细胞毒性试验 肿瘤放射敏感性实验等 四唑盐 MTT 比色法 操作步骤 100 L单细胞悬液接种于96孔板 5 104 37 5 CO2培养箱中培养一段时间加入2mg ml的MTT液 50 L 孔 继续培养3h 吸出孔内培养液后 加入DMSO液 150 L 孔 将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min 使结晶物溶解 酶标仪检测各孔OD值 检测波长570nm 记录结果 4 贴附生长细胞的生长过程 游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期 平台期 游离期 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态 也称悬浮期 此时细胞质回缩 胞体呈圆球形 10分钟 4小时 贴壁期 细胞附着于底物上 游离期结束 细胞株平均在10分钟 4小时贴壁 底物 胶原 玻璃 塑料 其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素 胶原等糖蛋白 生长基质 这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上 悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着 进口塑料培养瓶涂有生长基质 化学合成的功能基团 潜伏期此时细胞有生长活动 而无细胞分裂 细胞株潜伏期一般为6 24小时 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长 活力最佳 最适合进行实验研究 停止期 平台期 细胞长满瓶壁后 细胞虽有活力但不再分裂机制 接触抑制 密度依赖性 5 培养细胞生长性状的观察 1 常规观察2 活细胞的观察3 细胞生长状况的观察 97 5 1常规观察 细胞经原代培养后及传代或换液后均需进行连续的 动态性观察 每日或隔日观察一次 并做好相关记录 活细胞形态数量移动情况 98 常规观察 1 培养液2 细胞生长概况3 细胞形态变化4 微生物污染 99 常规观察 培养液 颜色和透明度的变化正常培养液的颜色新鲜培养基 桃红色 pH为7 2 7 4产生代谢产物 浅黄色 偏酸培养液很快变黄原因细菌污染培养瓶洗刷不彻底接种细胞密度过大 100 常规观察 细胞生长增殖 潜伏期或适应期 细胞系24h以内 原代培养几天 几周 对数生长期 长满80 及时传代 培养液变黄 平台期 细胞粗糙 细胞内颗粒状堆积物 细胞脱落 101 常规观察 细胞形态变化 生长状态良好的细胞透明度大折光性强轮廓不清有时可见到细胞分裂相 102 成纤维型细胞形态 103 上皮型细胞形态 104 常规观察 微生物污染 微生物污染一般发生在传代 换液和加药后 在进行上述操作后24 48小时要密切注意是否有污染发生 105 常规观察 微生物污染 细菌污染 培养液浑浊 可见细菌 霉菌 真菌污染 培养液浑浊 可见菌丝 支原体污染 培养液不浑浊 细胞生长变缓慢 胞质内颗粒增多 有中毒表现 106 2 3 8细胞冻存与细胞复苏 概述细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力 经费 减少污染 减少细胞生物学特性变化 最大限度的保存细胞活力 Spallanzani 1776 最早发表了 冷 处理对 细胞 生命活动影响的报道 1900年前后 科学家基本上肯定了生物成分 如精子 能够在零下温度贮存的事实 Polge等人 1949 发现了甘油对低温下贮存细胞的保护作用 Luyet 1951 与Lovelock 1953 等多位学者发现电解质浓度增大是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因 Lovelock等人 1959 发现了一种新的化学保护剂 这就是现在人们熟知的二甲基亚砜 DMSO 当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术 贮存时间几乎是无限的 细胞冻存 cryopreservation 将体外培养物悬浮在冷冻保护剂的溶液中 以一定的降温速率降至零下某一温度 70 并在此温度下对其长期保存的过程 复苏 thawing 以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程 109 细胞冻存与复苏原则 慢冻快融 当细胞直接降到零度以下 可引起 细胞器脱水 细胞中可溶性物质浓度升高 并在细胞内形成冰晶 会造成细胞膜 细胞器的损伤和破裂 冻存细胞时要缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 复苏过程应快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重结晶 110 低温保护剂的应用 采用甘油或二甲基亚砜 DMSO 做保护剂 常用DMSO 一种渗透性保护剂 易穿透细胞 提高胞膜对水的通透性 降低冰点 延缓冻结过程 能使细胞内水分渗出细胞外 在胞外形成冰晶 减少胞内冰晶 从而减少冰晶对细胞的损伤 常温下DMSO对细胞的毒副作用较大 在4 时 其毒副作用大为减弱 冻存时DMSO平衡应在4 下进行 111 细胞冻存方法 1 预先配制冻存液 含20 血清培养基 10 DMSO DMSO液用培养液配好 避免因临时配制产热而伤害细胞 2 取对数生长期细胞 冻存前一天换液 经胰酶消化后 加入适量冻存液 用吸管吹打制成细胞悬液 5 10 106个 ml 3 加入1 1 5ml冻存细胞液于冻存管中 密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期 程序降温仪 标准程序为 降温速率 1 2 min 当温度达 25 以下时 可增至 5 10 min 到 100 时 则可迅速浸入液氮中 细胞冻存盒 内部充满异丙醇 放入 70 冰箱中 1 min的降温速率冻存细胞 113 细胞冻存一般程序 1 先将冻存管放入4 冰箱 约10min 2 接着置于 20 冰箱 约30 60min 3 置于 80 超低温冰箱中放置12 16h 4 置于液氮罐中长期保存 114 细胞冻存简易程序 将冷冻管 管口要朝上 放入纱布袋内 纱布袋系以线绳 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口 按每分钟温度下降1 2 的速度 在30 40min内降至液氮表面 停30min后 直接投入液氮中 液氮罐 影响冷冻效果的因素 1 冷冻速率细胞冷至 5 15 之间时 细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态 细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动 冷冻速度慢 细胞内水分外渗多 细胞内溶质浓度增高 细胞内不发生结冰 但脱水严重 细胞体积严重收缩 甚至使细胞失去活性 冷冻速度快 细胞内水分没有足够的时间外渗 随着温度的下降会发生细胞内结冰 造成细胞膜及细胞器的破坏 2 冷冻保存温度液氮温度 196 是目前最佳冷冻保存温度 70 80 条件冷冻保存细胞 短期内对细胞活性无明显影响 时间延长 细胞存活率下降 3 复温速率是在细胞复苏时温度升高的速度一般复温速度越快越好1 2min内从 196 升温至37 水浴锅 4 冷冻保护剂可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 渗透性 甘油 DMSO非渗透性 聚乙烯吡咯烷酮 PVP 蔗糖 聚乙二醇 甘油或DMSO分子量小 溶解度大 易穿透细胞 可使冰点下降 提高细胞膜对水的通透性 且对细胞无明显毒性 甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰 在使用该类冷冻保护剂时 需要一定的时间进行预冷 注意事项 控制冻存细胞的质量不宜将冻存的细胞放置在 20 过长时间 易引起低温损伤冻存小管宜用塑料冻存管 保存细胞的复苏方法 快速解冻冻存细胞从液氮中取出后 立即放入37 水浴中 轻轻摇动冷冻管 使其在1min内 不要超过3min 全部融化解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶进行培养 24h后再用新鲜完全培养液替换旧培养液 以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂 然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中 准备水浴取冻存管 入水浴快速晃动至完全融化去除DMSO加入培养基制成细胞悬液 移入培养瓶培养 冻存和复苏的原则 慢冻快融 冷到零度以下 细胞可以产生以下变化 细胞器脱水 细胞中可溶性物质浓度升高 并在细胞内形成冰晶 如果缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 相反 结晶就大 大结晶会造成细胞膜 细胞器的损伤和破裂 复苏过程应快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重结晶 注意事项 尽快使细胞恢复到常温尽快离心弃去冷冻保护液 防止对细胞的毒害 2 3 9细胞的运输 由于培养细胞株 系 的商品化 细胞培养室之间的交流 交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分 培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节 如果不了解所要细胞的性状 培养液特点及培养注意事项 运输时不注意使用特殊容器或温度等 就可能影响细胞的生长 或出现差错 或导致培养失败等 装运细胞的主要方法如下 冷冻储存运输充液法 细胞的运输 冷冻储存运输 利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法 保存效果较好 但缺点是比较麻烦 不宜长时间运输 多需空运 代价较大 细胞的运输 充液法 一般选择生长良好的细胞 以生长1 3 1 2瓶底壁为宜 去掉旧培养液 补充新的培养液至瓶颈部 保留微量空气 拧紧瓶盖 并用胶带密封 放在一运送盒内 用棉花等做防震防压处理 运输时间需4 5d 一般放在贴身口袋即可 到达目的地后倒出多余的培养液 只需保留维持生长所需的培养液置37 培养 次日传代 如果在市内运输或仅需数小时运输路程 也可将细胞附着面朝上 或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送 靠附着于细胞表面的培养液 可使细胞短时间不受损 2 3 10细胞培养物的固定 染色 培养物的常用固定方法染色方法 1 常用固定方法 固定细胞的目的 把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来 避免组织和细胞发生降解 自溶 腐败和变形等 使细胞的化学物质和酶能准确定位 使细胞的各部分易于着色 适于观察 长期保存和分析 固定细胞的原则 尽可能选用新鲜培养物 根据检测工具 对象 目的和要求选择固定剂和固定方法 培养物的准备和固定前处理 各种细胞培养物 双盖片悬滴和悬液培养物 离心 PBS漂洗2 3次 固定制片 盖片单层培养物 盖片从培养器中取出 PBS漂洗2 3次 固定 常用固定液 简单固定液 甲醇 乙醇 醋酸 甲醛 戊二醛 丙酮 苦味酸 铬酸 重铬酸钾 氯化汞 氯化镉 锇酸混合固定液 Mueller固定液 Flernming固定液 FAA固定液 Carnoy固定液 Rossman固定液 Altmann固定液 Bouing固定液 常用固定液 FAA固定液 90ml80 的酒精中加入冰乙酸和40 甲醛各5mlCarnoy固定液 60ml纯乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液 75ml饱和苦味酸 100ml水中加入1 2 1 4g 过滤 加入25ml福尔马林 40 甲醛 有沉淀时禁用 再加入5ml冰醋酸 最好用前加 4 多聚甲醛 PBS 50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛 加热至60 70oC 边搅拌边逐滴加入2M的NaOH至液体清澈透明 用1M的HCl调pH至7 4 冷却后加入10mM的PBS至100ml锇酸 在棕色试剂瓶中加入50 100ml的0 1MPBS pH7 0 7 4 再将装有1g锇酸的安培瓶放入 击碎安培瓶 摇晃使锇酸溶解 2 染色方法 染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用和 或吸附作用 使各种细胞结构能够通过染色而改变其折射率 从而清晰的显现出来 影响因素 所用的固定液染液的pH值 组织的酸性成分用pH偏高的染液 碱性成分用偏酸染液 1 Giemsa染色 简便 快速 适用于多种细胞和染色体染色染色液现用现配 保存时间最好不超过48h Giemsa液对pH敏感 母液制备 Giemsa粉0 5g 甘油22ml 在研钵内将少量甘油和Giemsa粉混合研磨至无颗粒 加入剩余甘油 56oC保温2h 加入33ml甲醇 棕色瓶保存 染色步骤 盖片培养或涂片法 1 Sorensenbuf和Giemsa染液9 1体积比混合即得到染色液2 用甲醇固定细胞标本10min 或醋酸 甲醇 1 3 固定30min3 用滴管将染色液布满材料面 不要有气泡 4 染色10 15min 用自来水将玻片冲洗干净 空气干燥 二甲苯透明5 光学树脂胶封片后观察结果 细胞核染成紫红色或蓝紫色胞浆染成粉红色 2 苏木精 伊红染色 染液制备 1 苏木精染液 20 苏木精0 5g 铵矾 NH4 2SO4Al2 SO4 324g H2O50ml NaIO30 5g 甘油30ml 冰醋酸2ml 2 1 伊红染液 1g伊红溶于100ml蒸馏水 染色步骤 盖片培养法 1 37oC温PBS中漂洗3次 每次20 60sec 中性福尔马林固定30min2 蒸馏水漂洗1次 用蒸馏水稀释的1 苏木精染液染色10min 自来水洗后置入1 NaHCO3中漂洗至蓝紫色3 伊红水溶液中染0 5 1min 蒸馏水洗后迅速通过丙酮2次 每次3 5min4 通过2 1和1 2丙酮 二甲苯各3次 每次1 2min 纯二甲苯5 10min5 用光学树胶封片 注意勿将盖片的细胞面放反 后观察结果 细胞核染成红色 胞质染成蓝紫色 3 吖啶橙染色 吖啶橙 acridineroange AO 常用荧光染料 可用于活细胞 固定细胞染色 可与细胞中DNA和RNA结合而发出不同颜色的荧光 DNA亮绿色 RNA橘红色至火红色 快速 简便 并有一定特异性 染液配制 用生理盐水将AO配成1 的母液 冰箱保存 用时则0 1M的PBS pH4 8 稀释成0 01 工作液 染色步骤 盖片培养 1 Hank s液洗盖玻片上的贴壁细胞3次2 用95 乙醇固定细胞标本15 30min 滤纸吸干3 1 醋酸作用30sec PBS清洗1min4 用0 01 的AO染液染色1 5min PBS清洗1min5 0 1MCaCl2分色0 5 2min PBS清洗3次 每次数秒6 1 1的甘油 PBS封片 立刻观察 用激发波405的滤光片 4 免疫荧光染色 原理 用荧光素标记已知抗体或抗原 检查细胞或组织标本中相应的抗原或抗体 在荧光显微镜下 抗原抗体特异性结合部位的荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光 荧光素 异硫氰酸荧光素 FITC 发射荧光波长为490 619nm 黄绿色荧光 四乙基罗丹明 RB200 发射荧光波长为540 660nm 橙红色荧光 染色步骤 间接荧光染色法 1 用95 乙醇固定单层细胞标本10 30min 或冷丙酮固定5 10min PBS洗3次 每次5min 边洗边震荡2 滴加未标记的一抗液 37oC湿盒中30min PBS洗3次 每次5min 边洗边震荡3 滴加荧光标记二抗 37oC湿盒中30min PBS洗3次 每次5min 边洗边震荡4 去除玻片周围及材料上的水分5 荧光显微镜下观察 5 细胞活体染色 台盼蓝 用Hank s液配制0 1 台盼蓝溶液用等比的0 5 胰酶和0 2 EDTA混合液消化贴壁细胞加入适量Hank s液制成细胞悬液 每ml悬液中加入0 1 的台盼蓝溶液10ul并混匀细胞计数板计数1000个细胞中的活细胞 折光性强且不着色 和死细胞 染为蓝色 数目 6 细胞骨架染色 微丝 PBS洗盖片培养的细胞3次 每次0 5min2 的甲醛 PBS液固定3min0 5 的三硝基甲苯 PBS处理3次 每次10min PBS漂洗3次用罗丹明 rhodamine 标记的鬼笔环肽 phalloidin 1 10 室温中反应15min PBS漂洗3次60 甘油 荧光防淬剂封片后荧光显微镜观察 微管 PBS洗盖片培养的细胞3次 每次0 5min3 的甲醛 PBS液室温固定20min0 5 的三硝基甲苯 PBS处理3次 每次10min PBS漂洗3次 最后用滤纸吸干多余的PBS投入冷丙酮中 10 20oC 7min PBS漂洗3次 最后用滤纸吸干多余的PBS 微管 向一干净平皿中央滴一滴浓度为0 1 0 2mg ml的一级抗微管蛋白抗体 令小盖片细胞面向下扣在抗体液上 将平皿置37oC温箱中45 60min 加水盒 向平皿中缓缓加入PBS 浮起盖片并用镊子夹出 PBS漂洗3次 最后用滤纸吸干多余的PBS 向另一干净平皿中央滴一滴荧光标记的二抗 0 1 0 2mg ml 然后同操作 和 滴甘油 PBS 1 9 pH8 5 少许于载物片上 把小盖片的细胞面覆以大盖片上 并荧光显微镜观察 三维细胞培养 148 什么是三维细胞培养 如何实现三维细胞培养 水凝胶三维细胞培养 更多问题 2 3 4 1 什么是三维细胞培养 建立体外三维培养模型将有助于跨越二维细胞培养与动物实验之间的鸿沟 通过模仿体内环境的特性 并利用传统的细胞培养研究工具 三维细胞模型提供了独特的视角来观察干细胞的行为 组织器官和肿瘤的发展过程 这些研究模型有利于加速癌症生物学和组织工程领域的转化研究 1 三维细胞培养技术 three dimensionalcellculture TDCC 是指将具有三维结构不同的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移 生长 构成三维的细胞载体复合物 151 1 什么是三维细胞培养 3D 2D VS 153 2 如何实现三维细胞培养 水凝胶 固体支架 磁力悬浮 2 如何实现三维细胞培养 固体支架三维培养 组织工程支架作为组织工程的平台 不仅提供了细胞生长的框架 使之形成特定的组织或器官形状 而且作为细胞外基质成分之一 是细胞间信号传导和相互作用的媒介 同时也是细胞生长所必需的生物活性剂 目前用于组织工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯 聚偶磷氮 聚酸酐等 其中研究最多的是脂肪族聚酯 特别是聚乳酸 PLA 聚乙醇酸 PGA 及其共聚物等 2 如何实现三维细胞培养 磁力悬浮三维培养 美国莱斯大学和德克萨斯大学M D Anderson癌症中心的研究人员开发出一种生物装配器 bioassembler 这个系统使用磁力让细胞悬浮 并促使细胞生长成三维的形状 尤其适于培养肝脏和心脏这种细胞密度比较大的实体器官 2 如何实现三维细胞培养 将细胞培植在一定的细胞外基质中 细胞外基质 extracellularmatrix ECM 蛋白充当生长支架 水凝胶三维培养 3 水凝胶三维细胞培养 Matrigel CollagenI Agarose 3 水凝胶三维细胞培养 从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BDMatrigel基底膜基质 其主要成分由层粘连蛋白 型胶原 巢蛋白 硫酸肝素糖蛋白等组成 还包含生长因子和基质金属蛋白酶等 Matrigel 在室温条件下 聚合形成具有生物学活性的三维基质 模拟体内细胞基底膜的结构 组成 物理特性和功能 有利于体外细胞的培养和分化 以及对细胞形态 生化功能 迁移 侵染和基因表达的研究 可促进上皮细胞 肝细胞 Sertoli细胞 黑色素瘤细胞 血管内皮细胞 甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化 同时 Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达 支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化 高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等 3 水凝胶三维细胞培养 I型胶原在大部分组织中都有分布 尤其在骨组织 肌腱以及真皮组织中含量极其丰富 I型胶原一般是分离自大鼠尾中 也常被称为鼠尾胶 Agarose 在酸性条件下成液态 一般保存于醋酸溶液中 使用时 需用PBS稀释成合适的浓度 大于1mg ml 并用氢氧化钠调节PH值至7 2 7 4 可聚合形成具有生物学活性的三维基质 一般用于软骨细胞 骨细胞的三维培养 血管形成试验等 3 水凝胶三维细胞培养 美国布朗大学的生物工程师JeffreyMorgan利用琼脂糖开发出一种细胞三维培养皿 CollagenI 将融化的琼脂糖制成微型培养板 micro moulds 等琼脂糖凝固之