大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养.doc

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012年10月一、试剂1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2) DMEM（Invitrogen,11995-065）3) FBS（Invitroge,10099-141）64) Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5) B27（Invitrogen ,17504-044）6) GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8) 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9) DPBS（HyClone，SH30028.01B）10) dd H2O11) 10水合氯醛12) 75酒精二、器械1) 手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12) 200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3) 200目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6) 6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7) 直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9) 过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10) 注射器：50ml、5ml各 111) Pipette and pipette tips12) 冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100g/ml。2.3 以PLL包被培养板，量以覆盖培养板底面为宜。6孔板：1 ml per well；24孔板：0.5 ml per well；96孔板：0.1 ml per well。过夜。3、配置培养基、消化酶3.1 DMEM with 10% FBSFBS：DMEM=1：10取FBS 4ml、DMEM 40ml加入50ml离心管中混合。3.2 Neurobasal-B27-Glutamine MediumNeurobasal：B27=50:1Neurobasal：GlutaMAX =100:1取Neurobasal 50ml、B27 1ml、GlutaMAX 0.5ml，加入50ml离心管中混合。3.3 0.125胰酶取0.25Trypsin-EDTA 5ml,用HBSS稀释至10ml。将配置好的培养基、消化酶放入4C冰箱中，待第二天使用。4、消毒操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。Day 21、消毒打开操作台紫外线灯消毒30分钟。2、洗板用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。3、解剖孕鼠3.1 将已消过毒的解剖工具和已乘HBSS的小烧杯端入动物房。3.2 麻醉：取10水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。3.3 75酒精消毒切口部位。3.4 开腹（尽量开口大一些，便于后面操作）使用1把组织镊、1把组织剪。3.5 分离胎囊。换用另一幅直/弯镊、组织剪。3.6 将分离出的胎囊放入HBSS中。4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上进行）4.1 将盛放胎囊的烧杯放进操作台。4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。4.3 取3个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。将胎鼠从胎囊中取出，剪去头，将胎头放入一个培养皿中。4.5 用两支显微镊撕开脑膜，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的胎鼠都同样处理）。4.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。4.7 将分离好的脑膜用虹膜剪剪碎脑组织，约1mm3。5、接种细胞5.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。5.2 每支离心管加入3 ml 0.125胰酶，摇匀，37消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。）5.3 消化期间整理操作台。5.4 消化15分钟后，用移液管移去胰酶，每支离心管加入2 ml 10 FBS/DMEM终止消化。5.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10 FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。一共这样分次吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。）5.6 过筛网至60 mm培养皿中。5.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。5.8 离心：800转5分钟。5.9 弃上清，沉淀的细胞加10FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。5.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) 104 /ml5.11 调浓度，接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。具体细胞接种数值：培养液体积（ml/well）细胞密度（个/ml）总细胞数（个/ well）6孔板1.5ml1x1061x10696孔板0.1ml1x1061x1055.12 两小时后全量换液，换用NB27（应提前放入37细胞培养箱中预热半小时）。换液前轻轻晃动培养板（细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的