水中醛类化合物的测定.doc

水中醛类化合物的测定（三）主要试剂与材料的制备方法12,4-二硝基苯肼（DNPH）的纯化及空白检验（1）2,4-二硝基苯肼的提纯 1）在通风橱中，向200ml乙腈中加入过量的DNPH，煮沸1h。1h后，将上清液转移至带盖的烧杯中，放在40-60电热板上，使溶液逐步冷却至并使溶液温度保持在4060，直至95的溶剂蒸发为止。2）将溶液倒入废液缸中，再用多于上清液三倍以上体积的乙腈洗涤晶体二次。3）将晶体转移至另一个干净的烧杯中，加200ml乙腈，加热沸腾，在40-60让晶体慢慢长大，直至95的溶剂蒸发。4）重复1）3）的洗涤过程一次。5）取第二次洗涤液，用乙腈稀释10倍，再加入3.8mol/L高氯酸酸化后（每100ml洗涤溶液加1ml3.8mol/L高氯酸），用HPLC分析。纯化后的DNPH应保存在密封玻璃瓶中，再用密封胶带密封。只有使用纯化的试剂，才能使晶体中杂质的含量符合特殊要求。（2）2,4-二硝基苯肼纯度的要求对于重结晶后的DNPH试剂，用吸收瓶法采样时，如果采样60L，甲醛的空白要小于5ng/L，其它醛小于1 ng/L；如果用采样管法时，每个采样管的甲醛应小于0.15g。对一个实际样品，可接受的杂质浓度应小于等于样品处理到相同体积时待测物质含量（如甲醛DNPH衍生物）的十分之一。（3）饱和DNPH溶液的制备如果DNPH杂质浓度符合要求，另加25ml乙腈，盖上瓶塞并摇动试剂瓶后存放。已纯化的DNPH上面饱和溶液为试剂的贮备液，取用时，应使用干净的移液管，不要直接从试剂瓶中倒出储备液。2DNPH衍生物的制备（以甲醛为例）DNPH衍生物的标准可以直接购买商品标准样品，也可以用以下方法进行合成：1）将甲醛（37% w/w）溶液滴入到2mol/L HCl饱和的DNPH溶液中（如果需要测定其它醛酮类化合物，也可以滴入其它醛酮类化合物），形成沉淀。过滤有色沉淀，用2 mol/L HCl和水冲洗，并让沉淀在空气中干燥。用熔点测定法或HPLC分析检查甲醛-DNPH衍生物的纯度，甲醛腙衍生物的熔点为1671。如果含有杂质，用乙醇重结晶衍生物并重复进行纯度检查，必要时要重结晶，直到纯度达到99为止。2）甲醛-DNPH标准溶液的配制（100 mg/L）：准确称量10mg甲醛-DNPH衍生物溶解于100ml乙腈中配制标准贮备液。用标准贮备液配制混合标准使用溶液。所有标准溶液放置于冰箱中，能够稳定数月。（二）多组份羰基化合物的分离本方法分析的羰基化合物包括：甲醛、邻-甲基苯甲醛、乙醛、间-甲基苯甲醛、丙酮、对-甲基苯甲醛、丙醛、己醛、戊醛、丁烯醛（巴豆醛）、丁醛、苯甲醛、异戊醛、2,5-二甲基苯甲醛、甲基乙基酮。对于多组分羰基化合物的分离，应采用两根串联Zorbax ODS柱，用线性梯度进行分离，最佳色谱条件操作参数如下：色谱柱：Zorbax ODS，（两根串联）。检测器：紫外检测器、测定波长360nm。流动相：乙腈/水、线性梯度。流速为1.0ml/min。第一步 6075乙腈/4025水，30min。第二步 75100乙腈/250水，20min。第三步 100乙腈保持5min。第四步 60乙腈/40水反相梯度1min。第五步 60乙腈/40水，等梯度保持15min。进样体积：25l。用线性梯度程序分离丙烯醛、丙酮、丙醛和其它高分子量醛酮类化合物时，分析时间约1h。建立多种醛酮类化合物的最佳分离条件时，应至少将丙烯醛、丙酮和丙醛进行分离。 图2-6 梯度分离醛酮类化合物的色谱图（原图为TO-11A figure 15）我们做的方法1.4 色谱条件 色谱柱 PE 公司 Pecosil5 C18 柱，150 mm4.6mm ID，流速为1.0mL/min， 流动相为甲醇乙腈水，柱温25，检测波长 360 nm 。2.1 色谱条件的建立在11种醛酮类化合物的苯腙衍生物中， 丙烯醛与丙酮、丙烯醛与丙醛、丁醛与丁酮是最难分离的物质对， 一般在二元或二元梯度、三元等度分离体系即使使用长的18柱（25cm） 也很难分离，本文发现通过采用三元梯度法可以提高上述物质对的分离效果。 经考察优选确定出二元流动相为A（甲醇15）52、B（100） 48保持20.5 min， 然后以线性梯度4.5min后变化至 A 35、B65 ， 最后以 A 35、B 65保持15min，流速1.0mL/min，柱温26。三元流动相为 A（甲醇15） 72.5、 B（甲醇100）6.5、（乙腈100）21保持 10 min，然后以线性梯度35min后变化至A 43.5、B 6.5、C50， 最后以A 43.5、 B 6.5、C 50保持3 min，流速为1.0mL/min，柱温25，检测波长为 360 nm 。由图1可见所建立的二元梯度分离方法，11种醛酮类化合物除丙烯醛和丙醛未分离外， 其它九种组分基本上能够分离，但均未达到基线分离，在二元体系有许多未知小峰，对定量有一定的影响。用在C18短柱（15cm）进行三元梯度分离时，11种醛酮类化合物中除丙烯醛和丙醛在柱效高时可以分离， 丁酮、丁醛未达到基线分离外，其它七种组分均达到基线分离，也减少了未知小峰对定量的影响见图2。故本文选用三元体系梯度分离11种醛酮类化合物。2.2 柱温对醛酮类化合物分离的影响实验表明，柱温的变化对醛酮类化合物的分离效果有一定的影响。由图4可见，随着柱温的升高，各组分的保留时间降低，体系压力降低，但柱温变化超过40，丁醛、 丁酮的分离度降低。在分析时，柱温保持恒定，样品重现性好。考虑到柱子经长时间使用后柱效降低，丁醛、丁酮的分离效果差，以及采样夹中杂质的影响，本文选定分离时的柱温为25。2.3 检测限、线性范围及线性关系使用235C二极管阵列检测器， 自动采集11种醛酮化合物的苯腙衍生物的光谱图，确定出各标准物质的最佳检测波长为360nm。在最佳的分离条件下，测定了上述各组分保留时间的重现性、 最低检出量（三倍仪器噪声）、线性范围及相关系数见表1。 由表1可见，在测定的线性范围内各物质的含量与峰面积之间的相关系数均大于0.999。 表1 醛和酮DNPH在Pecosil5 C18柱上分析性能参数 Table 1 The analytical property parameters of DNPH derivatized aldehydes and ketones in Pecosil-5 C18 column Retention time tR/min Linear Correlation Detection Copound RSD range coeffi. limit 1 2 3 tR Sr/ mL/ng mmin/ng 甲醛DNPH 8.970 8.915 8.909 8.931 0.38 0-830 0.9997 0.45 乙醛DNPH 13.415 13.349 13.322 13.362 0.36 0-630 0.9996 0.60 丙酮DNPH 19.522 19.463 19.417 19.476 0.27 0-860 0.9991 0.50 丙烯醛DNPH 21.401 21.368 21.327 21.365 0.17 0-1735 0.9998 0.37 丙醛DNPH 丁酮DNPH 28.236 28.215 28.168 28.206 0.12 0-980 0.9992 1.07 丁醛DNPH 28.731 28.707 28.664 28.701 0.12 0-1010 0.9999 2.04 苯甲醛DNPH 33.763 33.752 33.703 33.793 0.09 0-1310 0.9997 0.68 正戊醛DNPH 35.827 35.819 35.770 35.805 0.09 0-1090 0.9997 1.00 苯乙酮DNPH 38.208 38.205 38.185 38.199 0.03 0-1240 0.9997 0.85 正戊酮DNPH 40.010 40.023 39.989 40.007 0.04 0-820 0.9997 0.73 通过比较标准DNPH衍生物的保留时间及峰面积来进行样品中羰基化合物的定性和定量分析。由于甲醛、乙醛、丙酮、丙醛、巴豆醛、苯甲醛以及邻、间、对-甲基苯甲醛可以基线分离，容易定性。而丁醛在上述色谱条件下由于和异丁醛同时流出，与甲基乙基酮部分分离，定性的可信度较小。图2-6是HPLC系统梯度分离醛酮类化合物的色谱图。（三）HPLC校准用DNPH-衍生物标准溶液（三、（四）2）配制至少五个水平的校准溶液，按与样品相同的分析步骤测定。25l进样体积所获得的线性响应范围约在0.0525g/l。用最小二乘法拟合曲线，回归曲线获得的相关系数至少为0.999（浓度对峰面积），曲线应该通过原点。如果曲线不通过原点，应该检查试剂和标准是否在准备过程中受到污染，如果没受到污染，计算时应扣除截距。曲线完成后需用第二来源的标准验证曲线，第二来源的标准回收率应在85%115%之间。表2-6 醛酮化合物及衍生物的分子量化合物名称英文名称DNPH衍生后的分子量化合物的分子量甲醛Formaldehyde21030乙醛Acetaldehyde22444丙烯醛Acrolein23656丙醛Propanal23858丙酮Acetone23858巴