DNA-RNA提取.doc

DNA的提取纯化编辑本段回目录一、细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR322类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素(g/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。二、细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1、大质粒(大于15kb) 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3、一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4、当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。 大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。三、质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每个碱基对大约结合个溴化乙锭分子) （antor 和chimmel,1980）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法，最近已得到改进（R.Treisman,个人通讯）并达到较高境界， 使用该方法可得到极高纯度的质粒。聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同，那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开，因此， 纯化容易带上切口的极大质粒（大于15kb）及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法。 然而， 两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA，包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。可幸，对于更常规的操作，则可全然免却进一步提纯的问题。目前所用的质粒大多数复制量大，小量制备质粒即可得到足量的DNA完成以下种种工作； 限制酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及放射性标记探针的制备。四、质粒DNA的小量制备一）细菌的收获和裂解、收获）将2ml含相应抗生素的加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30剧烈振摇下培养过夜。2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4。3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。2、煮沸裂解该法根据olmex和Quigley(1985)的方法改进而成。1）将细菌沉淀收获细菌和步骤）所得重悬于350lSTET中。STET0.1mol/L NaC10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-1002）加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振荡秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。4）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。6）在上清中加入40l 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420l异丙醇，振荡混匀，于室温放置分钟。7）用微量离心机于4以12 000g离心分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9）加1ml乙醇，于4以12 000g离心分钟。10）按步骤）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（）分钟。11）用50l含无DNA酶的胰RNA酶（20g/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20。i当从表达内切核酸酶的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶，以后在g2+存在下温育（中用限制酶时）质粒可被降解。 在上述方案的步骤）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。ii此法制备的高考贝数质粒（如f3哉p），其产量一般约为：每毫升原细菌增减物g。iii如果要通过限酶切割反应来分析，可取l溶液加到另一个含l水的微量离心管内，加l 10x限制酶缓冲液和单位所需限制酶，在适宜温度温育小时。将剩余的贮存于20。通过凝胶电泳分析经限制酸消化的片段。如果小量制备的不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤）或上述步骤）未能很好地去除所有液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提终产物，然后用乙醇重新沉淀，通常，用510倍过量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200l 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后， 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠（pH5.2）和倍体积乙醇沉淀。（二）质粒小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：1）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化。2）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。五、质粒DNA的纯化（一）聚乙二醇沉淀法质粒这里介绍的方法（R.Tresman,个人通讯）已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒。1）将核酸溶液上页步骤）所得转入15mlorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用orvall SS34 转头（或与其相当的转头）于4下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子。2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。4）用500l含无酶的胰酶(20g/ml ）的（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。5）加500l含13（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于以12000g离心分钟，以回收质粒。6）吸出上清，用400l TE(pH8.0)溶解质粒沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽次。7）将水相转到另一微量离心管中，加100l 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于以12 000g离心分钟，以回收沉淀的质粒。8）吸去上清，加200l处于以12 000g离心分钟。9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500l（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释用（pH8.0) 后测量260，计算质粒的浓度（26050g质粒/ml）， 然后将贮于20。（二）氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环1、连续梯度1）测量溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。2）每10ml溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表成）与氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度应为大约g/ml。溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子）。于室温保存。3）于室温用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000转/分离心分钟， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。4）用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到适用于Beckman Ti65重直转头或i50、Ti65或Ti70 角转头（或与它们相当的转头）的离心管（Beckman Quick-seal或与之相当的离心管）中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。5）于20对所得的密度梯度以45 000转/分离心16小时（VTi65 转头）、 以45000转/分离心48小时（Ti50转头）、以60 000转/分离心24小时（Ti65转头）或者以60 000转/分离心24小时（Ti70.1转头）。在普通光照下，在梯中心可见两条区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）和带切口的环状质粒组成：下部区带则由闭环质粒组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭复合物，位于sCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。BeckmanQuick-Seal离心管中的CsCl溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个区高水平时才会出现，只要产将该质粒提取物分为个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个区带，用CsCl溶液（1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使达到平衡。6）收集带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后用一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将号皮下注身针头（其斜面向上）斤插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体区带之下并与该区带相平行。将粘稠状收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封信皮下注射针头的未端并将第根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第根皮下注射针头（18号），将下部的质粒区带收集到玻璃或塑料管中。2、不连续梯度该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中，这样可以加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到小时。1）将125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（1.47g/ml）。2）将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管（或与其相当的管）中，搁置一旁等步聚）使用。3）如有必要，可酌情用TE(pH8.0)将质粒溶液的体积精确地调到3ml。4）在质粒溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30以促进盐溶解， 小心地混匀溶液直至盐溶解。5）称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g，用天平称量时应注意去除管的重量。6）加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水），快速混匀溶液直至染料均匀地分散，此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。溴化乙锭贮存液应于室温贮存在避光容器中（如完全用锡箔包裹的瓶子）。小心：溴化乙锭是一咱强诱变剂，并在中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。7）于室温用Sorvall SS34转头（或与之相当的转法）以8000转/ 分离心分钟，浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。8）将22.86cm的巴期德吸管放入装有步骤）制备的CsCl的离心管中， 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤）所制备的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内，使样本层位CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情步骤）中制备的CsCl溶液（=1.47g/ml)添满离心管，封口。9）将封口的管，（与相应的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头（或与之相当的转头中），于20以60 000转/分将密度梯度离心小时。10）回收闭环质粒区带（三）从经过纯化的质粒中去除溴化乙锭下面方法对于从经过氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心纯化的中去除溴化乙锭都同样奏效。方法：有机溶剂抽提小心：溴化乙锭是一种强诱变剂，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。用后这些溶液应用后述的方法进行净化处理。1）将溶液放入玻璃或塑料管中，加等体积的水饱和丁醇或异戊醇。2）振荡混合两相。3）用台式离心机于室温以1500转/分离心分钟。4）用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。5）反复抽提步骤）次直到粉红色从水相和有机相中均消失。6）用以下任意一种方法从溶液中除CsCl：通过微量浓缩器（Amicon）进行旋转透析，对TE(pH8.0)透析24-48小时，并换液数次或者用倍体积水进行稀释并于用倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的倍）沉淀15分钟，再于以10 000g 离心15 分钏， 将沉淀的溶于约1ml TE(pH8.0)中。如将的乙醇溶液置于-20，CsCl会沉淀。7）测定终溶液的260值，计算的浓度， 将分成小份贮存于-20。如果终制备的含有显著量的溴化乙锭（依颜色判断），可用酚、酚：氯仿各抽提次，然后用乙醇沉淀。（四）溴化乙锭溶液的净化处理小心：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。1、溴化乙锭浓溶液（即浓度0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液）的净化处理方法： 用少门氏菌微粒体测定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。1）加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。2）加入0.2体积新配制的次磷酸和0.12体各新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠，混匀。切记：检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。3）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些， 该溶液可予丢弃。返回切记：检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。3）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些， 该溶液可予丢弃。(五)从质粒制品中去除对于某些用途（例如用31进生活化或用噬菌体多核苷酸激酥标记质粒的限制切片段的端），必须获得无污染的制品。尽管在通过氯化铯化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒中，这样的污染物的重量微不卟道，但对说来，其中的分子数却可能相当可观，并可在限制酶消化反应的全部端中占据砂容忽视的比例。通过下述方法，可以从质粒制品中去除A 。1、通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析1）制备质粒。2）有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提次。3）将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。4）将装入层柱并在柱的上部连接上含0.1的TE(pH8.0)的贮液瓶，立即开始以0.5ml流出液为流进行收集。5）当收集到15份时，关闭柱底部，为明确质粒的分布情况，可心众每份收集物中取10g样品，通过0.7琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光（见附录）进行分析。6）将含质粒的组成合并在一起，加倍体积的乙醇于沉淀10分钟，然后于以大于10 000g离心15分钟，以回收。基因组DNA的提取编辑本段回目录基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。4、加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀，50水浴3h5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20预冷无水乙醇。-2020min。9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。从植物组织提取基因组DNA 编辑本段回目录一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液：100mmol/L TrisCl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液, 60水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。 9. 加入5l RNaseA(10g/l), 37 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2体积的冰乙醇,混匀,-20放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。 13. 取2l DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15l稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。注意 5g样品可保证获得500g DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA 1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。 2. 加入提取缓冲液10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液20ml, 混匀。65, 30-60min, 常摇动。 4. 同（一）中步骤3-13操作。 从动物组织提取基因组DNA编辑本段回目录一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂 1、分离缓冲液：10mmol/L TrisCl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步骤:1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。 3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保温1-2小时, 直到组织完全解体。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5l RNaseA(10g/l), 37保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。 细菌基因组DNA的制备 编辑本段回目录一、材料 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤：1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温1小时。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65保温20分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以上一节的操作步骤处理。 基因组DNA的检测编辑本段回目录上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 2. 取2-5l 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。 3. 取2g DNA, 用10单位(U)Hind酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。组织DNA的提取和纯化编辑本段回目录原理 本法用含EDTA的溶液洗涤细胞，SDS（十二烷基硫酸钠）破碎、裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚并使细胞内的DNA酶失活，用酚、氯仿变性蛋白质并去除杂质，最后用乙醇沉淀得到纯化的DNA。试剂裂解缓冲液1、 苯酚-氯仿溶液2、 氯仿-异戊醇溶液3、 冰无水乙醇及70%乙醇4、 TE缓冲液5、 5mol/L NaCl操作处死小白鼠一只，取新鲜肝脏，用生理盐水清洗去血水。1、 每克组织加10ml裂解液制成匀浆。2、 取2ml匀浆于离心管中，加等体积苯酚-氯仿溶液，加盖，缓缓来回颠倒5min， 离心2500rpm10min。3、 取上层水相，加等体积氯仿-异戊醇溶液，加盖，缓缓来回颠倒5min，离心 2500rpm10min。4、 取上层水相至玻璃管内，加5mol/L NaCl至终浓度为0.3mol/L（2ml+100ul，3ml+150ul）。5、 加2.5倍体积的冰无水乙醇，加盖，缓慢摇匀，见白色絮状沉淀DNA出现。6、 用玻棒捞起DNA沉淀置于试管中，用1mLTE溶解。7、 定量 吸取DNA溶液100ul+2.9mlTE（30倍稀释），在260nm和280nm下读 取吸光度值，8、 计算 DNA浓度（ug/ml）=A260nm501/光径稀释倍数石蜡包埋组织的DNA提取及其应用编辑本段回目录一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。表 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤1切除多余石蜡，暴露组织2将组织切碎（最大径0.5mm），称重；3溶于TE9提取液（组织20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关外，可能的原因还有：组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；蜡块贮存的时间长短不一。虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA变性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。三、提高DNA提取质量的方法1蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。2DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们从不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化时间和DNA纯化等问题上取得了进展。DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DAN与蛋白质不易分离。因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1%2%，蛋白酶K200500g/ml，最高可达1mg/ml；作用时间一般为24天，最长可达7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba等发现，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能够得到令人满意的完整DNA。尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2-巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2-巯基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得