一氧化氮介导的呱氨托美汀镇痛作用机理研究.doc

一氧化氮介导的呱氨托美汀镇痛作用机理研究李元海 张健 李 俊 黄 艳 吕雄文 金 涌 张磊 葛金芳(安徽医科大学第一附属医院麻醉科 合肥 230022）摘要 目的 探讨一氧化氮(NO)介导的呱氨托美汀(AMG)镇痛作用机理。方法 利用AMG对冰醋酸（AA）扭体疼痛小鼠的镇痛作用；测定其脊髓、脑和血液的NO2-，一氧化氮合酶(NOS)含量。L-Arg, L-NAME对AMG在AA与福尔马林（FA）致痛小鼠的镇痛作用；测定L-Arg, L-NAME对AMG在AA扭体镇痛小鼠脊髓、脑和血液的NO2-含量。结果 在AMG对AA扭体致痛小鼠镇痛作用中， AMG大剂量（300 mgkg-1）组与中剂量（150 mgkg-1）组小鼠脊髓NO2-含量和模型组比较显著降低（P0.05），但是脑和血液未见显著变化。AMG+L-Arg组和AMG组比较小鼠15min内扭体次数显著增多（P0.05）；而AMG +L-NAME组和AMG组比较小鼠15min内扭体次数显著下降（P0.05）。L-Arg, L-NAME对AMG在AA扭体致痛小鼠镇痛，AMG（150 mgkg-1）组小鼠脊髓NO2-含量和模型组比较显著降低（P0.05）。AMG和L-NAME可减少FA致痛小鼠第二时相累计舔足时间。结论L-Arg和L-NAME可能对AMG镇痛作用有一定影响，AMG可能通过抑制NO的生成发挥脊髓的镇痛作用。关键词 一氧化氮，呱氨托美汀，镇痛一氧化氮（nitric oxide, NO）作为细胞间信使分子参与脊髓,脊髓上和外周三个水平伤害性信息传递过程已被许多学者证实1，2，3, 但是NO参与痛觉调节存在着相互矛盾的结果,有些L-Arg-NO-cGMP信息传递对外周伤害性感受器有直接的抑制作用,可产生镇痛作用,但相反的报道NO供体, cGMP类似物对痛敏有促进作用,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂(如L-NAME)对它有抑制作用4。呱氨托美汀（Amtolmetin Guacyl ,AMG）是一种新的非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)，具有抗炎、镇痛、解热作用，AMG的代谢产物MED5和托美汀（Tolmetin,TOL）,也具有抗炎镇痛作用。同时AMG诱导胃粘膜诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达，增加胃粘膜上皮细胞合成、释放一氧化氮，保护胃粘膜免受酒精、药物等损害，达到保护胃粘膜的作用5,6,7,8。探讨AMG是否通过调节脑、脊髓、外周的NO水平，发挥镇痛作用，从而对AMG镇痛作用机理进行一些探索性研究。1 材料11药品AMG科隆药业有限公司提供，TOL科隆药业有限公司提供，羧甲基纤维素钠（CMC）上海三浦化工有限公司提供。12试剂 NOS试剂盒南京建成生物工程研究所供应。AA安徽省蚌埠市皖达试剂厂生产。FA广东省汕头市西陇化工厂生产。萘乙烯二胺盐酸盐由中国医药上海化学试剂公司提供。对氨基苯磺酸由同济大学应用技术研究所提供。5%磷酸由安徽省铜官山化工总厂生产。生理盐水由安徽丰原药业股份有限公司无为药厂生产。L-Arg 购于Sigma公司，L-NAME购于Fluka 公司。13动物 体重1822g昆明种小鼠，普通级，安徽医科大学实验动物中心（皖科动物准字001号）供应。2 方法21剂量与分组 AMG对AA扭体疼痛小鼠镇痛作用中，60只昆明种小鼠、各半，随机分6组，每组10只。正常对照（Normal）组（NS 0.2ml，ip），模型 (Model)组（给CMC），TOL 90 mgkg-1组，AMG 75 mgkg-1组、AMG150 mgkg-1组、AMG 300 mgkg-1组。L-Arg, L-NAME对AMG在AA致痛小鼠镇痛作用，120只昆明种小鼠、各半，随机分12组，每组10只。Normal组（NS 0.2ml，ip），Model 组（给CMC），TOL 90 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1组，L-Arg75 mgkg-1组, L-NAME40 mgkg-1组， TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1组，TOL 90 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1组，TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 +L-NAME40 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1组。L-Arg, L-NAME对AMG在FA致痛小鼠镇痛作用，110只昆明种小鼠、各半，随机分11组，每组10只。Model组（给CMC），TOL 90 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1组，L-Arg75 mgkg-1组, L-NAME40 mgkg-1组， TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1组，TOL 90 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1组，TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 +L-NAME40 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1组，AMG150 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1组。22 冰醋酸扭体致痛试验9分别CMC，TOL，AMG ig60min,和/或sc射L-Arg，L-NAME 20min后,ip冰醋酸0.2ml。记录15min内小鼠扭体次数,按以下公式计算抑制率: Model组扭体次数均数- 受试药组扭体次数均数抑制率 = Model组扭体次数均数 * 100%23 福尔马林致痛试验10，11 分别CMC，TOL，AMG灌胃(ig)60min,和/或皮下（sc）注射L-Arg，L-NAME20min后, 在小鼠右后足底注射5%FA10l。观察其舔足反应，并分别在05min，1530min二个时相记录小鼠累计舔足时间（s）。 2. 4 脑和脊髓匀浆制备 在扭体20min后小鼠眼球取血，同时取脑和脊髓称重，加冷生理盐水，制成10%的脑和脊髓的组织匀浆，离心(4000g, 10min)取上清，测NO2- 和NOS的含量。2. 5 NOS 测定 按NOS试剂盒说明书的操作步骤进行。26 NO2- 含量的测定 参照Prado WA et al 12方法 ，Griess试剂配制，用双蒸水配制0.1%萘乙烯二胺盐酸盐（NED）一份。用5%磷酸配制1%对氨基苯磺酸一份，上述两份试剂试验前等量混匀。取血清、脑脊髓组织上清液100l，加Griess试剂100l室温静置10min后用酶标仪在540nm处测定其吸光度（OD）。27 统计学处理 用SPSS10统计学软件进行统计学处理，计量资料xs表示，单因素方差分析（ANOVA），Tukey检验差异显著性，P0.05表示差异有显著性。3 结果31 AMG对AA致痛小鼠脊髓、脑与血液NO2-的影响如表1所示Model组、TOL组与Normal组比较脊髓和脑组织、血液的NO2-含量显著上升（P0.05）；而AMG（300,150 mg kg-1）脊髓和血液的NO2-含量与Model组比较显著降低（P0.05）；AMG（300,150,75 mgkg-1）脑组织上清液NO2-含量与Model组比较均显著降低（P0.05），32 AMG对AA致痛小鼠脊髓、脑与血液NOS的影响如表2所示Model组、TOL组脊髓和脑组织的NOS含量与Normal组比较显著升高（P0.01），而AMG（300、150 mgkg-1）均能使脊髓和脑组织的NOS含量明显下降。提示AMG与TOL的镇痛作用机制有所不同，AMG对NOS的抑制作用可能主要在脊髓和脑。Tab1 The effect of AMG on Spinal cord, brain, blood NO2- concentration in writhing test of mice（n =10, s）GroupsDose/mgkg-1Spinal cord/molmgprot-1Brain/molmgprot-1Blood/molL-1Normal-5.221.449.252.4215.143.86Model-6.931.50*11.982.19*18.594.37*TOL906.771.93*11.572.09*18.064.52*AMG755.821.779.761.1516.534.061505.521.129.102.3615.573.583005.371.118.232.0115.333.18*P0.05 vs normal group； P0.05, P0.01 vs model groupTab2 The effect of AMG on spinal cord, brain,blood NOS concentration in writhing test of mice（n =10, s）GroupsDoses/ mgkg-1Spinal cord/Umgprot-1Brain/Umgprot-1Blood/Uml-1Normal-8.070.092.240.6521.323.98Model-12.363.07*3.851.24*23.291.82TOL9011.613.76*3.331.17*23.532.58AMG7510.442.812.980.9122.452.5815010.322.532.480.8522.123.663009.881.642.190.6222.893.80*P0.05, *P0.01 vs normal group；P0.05, P0.01 vs model group33 L-Arg与 L-NAME对AMG的AA致痛小鼠镇痛影响如表3所示AMG+L-Arg组和AMG组比较小鼠15min内扭体次数显著增多（P0.05），提示L-Arg可能有拮抗作用；而AMG +L-NAME组和AMG组比较小鼠15min内扭体次数显著下降（P0.05），与L-NAME具有协同作用有关，L-Arg和L-NAME可能对AMG镇痛作用有一定影响。提示AMG的镇痛作用与TOL不完全一样，部分是通过抑制NO产生而发挥其镇痛作用。Tab 3 The effect of L-Arg, L-NAME on the antinociception of AMG in the writhing test of mice （n =10, s）GroupsnDoses/mgkg-1Number of writhing/number/ 15minInhibition rate/ %Model10-36.206.890.00TOL109022.104.75*38.95AMG1015023.404.45*35.36L-Arg107537.207.25-2.76L-NAME104028.105.97*22.38TOL+L-Arg10100+7523.805.28*34.25TOL+L-NAME10100+4020.903.45*, 42.27TOL+L-Arg+L-NAME10100+75+4020.803.65*42.54AMG+L-Arg10150+7528.506.28*21.27AMG+L-NAME10150+4018.102.92*#50.00AMG+L-Arg+L-NAME10150+75+4023.604.91*,34.81*P0.05, *P0.01；vs model group; P0.05, AMG vs AMG+L-Arg; #P0.05 AMG vs AMG +L-NAME34 L-Arg与L-NAME对AMG镇痛小鼠脊髓、脑和血液NO2-影响在L-Arg，L-NAME对AMG在AA致痛小鼠镇痛作用中，Model组脊髓和脑组织上清液、血液NO2-含量与Normal组比较均明显升高（P0.05， P0.01）。而AMG，L-NAME，AMG+L-NAME组脊髓和脑组织上清液NO2-含量与model 组比较显著下降（P0.05， P0.01），L-Arg，AMG+L-Arg+L-NAME脊髓组织上清液NO2-含量与AMG组比较有显著上升（P0.01），进一步提示 AMG镇痛作用可能与抑制脊髓和脑组织释放NO有关，结果如表4所示。Tab4 The effect of L-Arg,L-NAME on the spinal cord NO2- concentration of AMG antinociception in the writhing test of mice （n =10, s）GroupsDose/mgkg-1Spinal cord/molmgprot-1Brain/molmgprot-1Blood/molL-1Normal-4.641.823.730.9714.644.29Model-6.642.02*6.242.13*17.104.53*TOL905.992.325.220.5317.455.51AMG1505.161.134.060.7616.062.20L-Arg759.792.817.931.1920.203.57L-NAME404.861.664.031.0817.924.22TOL+L-Arg90+756.482.245.571.7119.793.85TOL+L-NAME90+405.791.344.651.4318.947.98TOL+L-Arg+L-NAME90+75+405.631.735.132.3218.167.37AMG+L-Arg150+757.532.495.851.4919.386.73AMG+L-NAME150+404.611.474.030.8215.675.78AMG+L-Arg+LNAME150+75+407.363.376.610.9018.213.77*P0.05, *P0.01 model group vs normal group; P0.05, P0.01 vs model group;P0.05 P0.01 vs AMG group35 L-Arg与 L-NAME对AMG的FA致痛小鼠镇痛影响如表5所示，无论是TOL还是AMG各给药组对FA诱导第一时相小鼠舔足时间均无明显影响。而在FA诱导的第二时相，TOL与AMG均对第二时相小鼠累计舔足时间有明显的抑制作用，而L-Arg 与AMG联合应用则明显增加第二时相小鼠累计舔足时间，AMG与L-NAME联用则可以逆转上述现象，L-Arg 与TOL联合应用对小鼠累计舔足时间却无明显影响。提示AMG的镇痛作用与调控中枢与外周的NO或NOS有关。Tab 5 The effect of L-Arg, L-NAME on the antinociception of AMG in the formalin test of mice（n =10, s）GroupnDosemgkg-1Total paw-licking time/sFirst phase(0-5min) Second phase(15-30min) Model10-27.765.28166.7825.67TOL109027.405.8665.0515.94*AMG1015026.606.5163.0714.39*L-Arg107527.585.76194.1325.91L-NAME104025.885.98135.4825.44*TOL+L-Arg10100+7526.736.5272.2615.72*TOL+L-NAME10100+4026.528.1760.4014.99*TOL+L-Arg+L-NAME10100+75+4027.038.8764.0912.49*AMG+L-Arg10150+7525.565.65130.0316.73*AMG+L-NAME10150+4028.175.8542.6911.56*AMG+L-Arg+L-NAME10150+75+4026.317.2465.0015.59*#*P0.05, *P0.01 vs model；P0.05, P0.05 vs AMG； #P0.05 AMG+L-NAME vs AMG+L-Arg+L-NAME4 讨论一氧化氮（nitric oxide NO）是小分子量的生物活性气体分子，可自由通过神经元细胞膜，半衰期只有数秒（3-5秒）。催化NO生物合成的酶称为一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS），NOS以L-精氨酸（L-Arg）和分子氧为底物，反应生成NO和L-瓜氨酸。目前认为NO在脑、脊髓、外周多个层面调控疼痛，在不同浓度具有镇痛、致痛、甚至致瘫作用13。鞘内注射（it）NO供体3-morpholinosydnonimine(SIN-1)0.1-2.0g/10l 降低大鼠坐骨神经结扎所致痛敏产生镇痛作用。而SIN 10和20ug/10ul可能增加其痛敏，产生致痛作用，SIN 5或100g/10l 不产生镇痛和痛敏作用。鞘内注射SIN 0.1-100g/10l 只对大鼠的缩尾试验具有镇痛作用，因此随着剂量和动物模型的不同，NO可能具有镇痛、致痛双向调节作用4。进一步研究表明，NO前体（如L-Arg）随着剂量增加10-100mg/kg具有剂量依赖性致痛-镇痛-致痛三相模式，而NOS抑制剂（如L-NAME） 18.75-150mg/kg具有镇痛作用14。呱氨托美汀的化学名称：2-甲氧基苯酯，1-甲基-5（p-甲苯甲酯吡咯），2-乙酰胺乙酸酯(2-methoxyphenyl 1-methyl-5p-methlbenzoyl pyrrole-2-acetamide acetate, MED15，ST679)， AMG及其代谢产物MED5和TOL的化学结构式（如图1）。呱氨托美汀是一种新的非甾体抗炎药，具有抗炎、镇痛、解热作用。非选择性抑制环氧化酶（COX），减少前列腺素释放，发挥抗炎、镇痛作用5。AMG通过增加胃粘膜上皮细胞一氧化氮合酶（NOS）的活性，促进其释放一氧化氮（NO），不但降低AMG对胃粘膜的损伤，而且对乙醇诱导的胃粘膜损伤有保护作用5，6，这是托美汀等其他非甾体抗炎药不具备的优点。临床试验研究表明呱氨托美汀对急性疼痛、术后疼痛等具有较强的镇痛作用15，16。从上述化学结构式可知，AMG在降解成TOL的同时释放呱氨基团，而NOS以L-精氨酸（L-Arg）和分子氧为底物，反应生成NO和L-瓜氨酸。AMG是否通过其释放的呱氨基团反馈性抑制NO的生成，过去的研究未见报道。本实验结果表明AMG大、中2个剂量组对AA致痛模型小鼠脊髓NO含量有明显抑制作用,但是其NOS含量未见明显下降。进一步说明AMG不是通过抑制NOS表达而抑制NO合成,而是可能通过其生成呱氨基团竞争性抑制