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Western Blot【实验原理】： Western Blot 印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF 膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X 光片曝光、 显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。Western blot 实验分为三个部分：1 样品蛋白质的制备、 蛋白质含量测定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳3 凝胶转膜及其检测以提取细胞蛋白为例Western 印记杂交实验流程图： 提取细胞总蛋白、测定含量制备SDS-PAGE 胶蛋白样品变性、电泳电泳转膜封闭一抗TBST 洗涤HRP 标记的二抗TBST 洗涤ECL 试剂作用X-光片曝光、显影结果分析细胞总蛋白的提取及含量测定一、细胞总蛋白的提取提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多。其目的都是要获取高丰度、高品质的蛋白质,以满足实验需要。在提取蛋白质实验中要特别考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的种类很多，如PMSF(苯甲基磺酰氟)；金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇双四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根据具体情况具体选择。制备蛋白质样品应遵循下述原则：1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白酶的降解。3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80。切勿反复冻融已制备好的样品。（一）试剂1细胞总蛋白裂解缓冲液：蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提,)2PMSF 储存液(100mmol/L)： 称取PMSF 17.4mg，溶于1ml 异丙醇，分装后储存于-20。注意: PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定，故应在临用前再加入到细胞裂解缓冲液中， 使其终浓度为0.174mg/ml，如：1 ml 细胞裂解液中，加入10ul PMSF 储存液.（二） 仪器和耗材 冷冻离心机无菌的Tip 头、1.5ml 及0.5ml 离心管 ，（三） 实验材料 Hela 细胞（四） 实验步骤1细胞的预处理：由37 CO2 培养箱中取出于60mm 细胞培养皿中培养的Hela 细胞，（细胞数约为5106 ），吸弃原培养液，用4预冷的1PBS 洗细胞表面34 次，以去除培养基中的血清及死细胞，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。将洗涤后细胞直接冻存于-80冰箱，待提取蛋白质。此方法可保存细胞至少两周。（注：如果需要，当用PBS 洗涤细胞后，不必-80冰箱冻存，可直接进行步骤2）2（由-80冰箱中取出细胞培养皿，将其置于冰上，） 向上述各培养皿中加100ul 含PMSF 的蛋白提取液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。3冰浴40 分钟（通常冰浴时间为3060 min），期间晃动3-4 次培养皿，使其作用均匀。4用Tip 头集中蛋白提取液，将其收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管中，4离心，12,000g 20min。5将上清液小心移入预冷的0.5ml 离心管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80保存备用。（五）操作注意事项1注意个人防护。PMSF 严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗2所用离心机需提前预冷。3吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。二、细胞总蛋白含量测定：蛋白质的定量，目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、BCA法、Lowry法（Folin-酚试剂法）等。但各有优缺点，客户可以根据具体情况选取。本实验仅以Bradford 方法为例。 试剂1. 4mg/ml BSA 标准蛋白液：10l/管，4保存。临用前，加入70l 生理盐水，配制成0.5mg/ml。2. 5Bradford 试剂3考马斯亮蓝G-250 使用液a. 考马斯亮蓝G-250 母液： 称取考马斯亮蓝G-250 100mg,溶于50ml 95%乙醇；加入100ml 85%浓磷酸(w/v)。过滤，4保存6 个月。b. 考马斯亮蓝G-250 使用液（ 0.01%考马斯亮蓝G-250）：取考马斯亮蓝G-250 母液 15ml加蒸馏水稀释至 85ml(临用前稀释 ) 仪器 分光光度计及玻璃比色皿 实验步骤1. 稀释5Bradford 试剂：如欲配制15ml 考马斯亮蓝使用液, 则： 5Bradford 试剂3ml, 蒸馏水12ml, 充分混合；2 稀释BSA 标准品及制作标准曲线：用生理盐水或PBS 将0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液分别稀释成0、2、4、6、8、10ug/100ul(分别编号：1、2、3、4、5、6、)浓度；3向上述不同浓度BSA 管中分别加入1.5ml Bradford 使用液， 混合均匀后移至玻璃比色皿中，于紫外分光光度计上测定595nm 吸光度值（OD595），依据所得数据制作标准曲线；4稀释待测蛋白样品：吸取细胞总蛋白样品2 ul，加入98ul 生理盐水或PBS（总体积为100ul），混合均匀后加入1.5ml 考马斯亮蓝使用液，混匀后测定595nm 吸光度值（OD595）；5计算样品总蛋白含量（ug/ul）：根据标准曲线图，找出样品蛋白在图中的位置，计算出蛋白含量。（四） 注意事项1制作的BSA 标准曲线如不规律，应重新再做。2 如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释1020 倍后测定；如样品浓度低，可适当增加样品ul 数及减少生理盐水或PBS 的ul 数3 比色皿的清洁： 考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后的比色皿除用清水冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分钟以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和既有浓缩胶又有分离胶的不连续系统. 聚丙烯酰胺凝胶电泳在不连续缓冲系统中进行，具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，大大提高了SDS-聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。当对蛋白质样品要做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时，要在样品中加入含有SDS 和-巯基乙醇的样品处理液。SDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； -巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，要经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。 当样品上样并接通两极间电流后，凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS 多肽复合物向前推进。样品首先通过高度多孔性的积层胶，使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按双丙烯酰胺：丙烯酰胺为1：29 配制，实验表明它能分离大小相差只有3%的多肽。 借助于已知分子量的标准参照物(蛋白分子量Marker)，则可推算出多肽链的分子量。聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（） 线性分离范围（KD）15 10 4312 12 6010 20 807.5 36 945.0 57212一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液4 浓缩胶缓冲液 (Stacking gel Buffer, pH 6.8)4 分离胶缓冲液 (Resolving gel buffer pH 8.8)10 SDS-PAGE电泳缓冲液10 蛋白电转移缓冲液 (10 Transfer buffer)10 封闭-洗涤缓冲液2 SDS-PAGE Sample/Loading Buffer5 SDS-PAGE Sample/Loading Buffer (inhibiting dephosphorylation)10% SDS溶液1.5 M Tris-Cl pH8.81 M Tris-Cl pH 7.41 M Tris-Cl pH 6.81 M Tris-Cl pH 8.0（一）试剂配制130% 丙烯酰胺（29：1）：21.0mol/L Tris-HCl pH 6.831.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8410%SDS（室温保存）: 510%过硫酸铵（4保存）： 6TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）：催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合；7.Tris -甘氨酸电泳缓冲液(1000ml):82蛋白质电泳上样缓冲液9. 蛋白质预染Marker（二）实验仪器及耗材垂直电泳槽稳压稳流电泳仪/电转仪蛋白变性用加热仪器无菌Tip 头、 Ep 管、碎冰 、注射器等（三）实验步骤1制备SDS-PAGE 凝胶（1）准备SDS-PAGE 凝胶用玻璃槽：将两条垫片放入两块特制玻璃板中间（其中一块为凹形），用透明胶带将两边及底边封严。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。（2）配制10%SDS-PAGE 分离胶 (15ml)：去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5.0ml1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml10%过硫酸胺 0.15ml10%SDS 0.15ml取上述液体1ml, 加入TEMED 3ul, 混匀后用其封凝胶用玻璃槽周边（3）灌制分离胶：待封边胶凝固后，在其余14ml 分离胶液中加入7 ul TEMED，混合均匀，用吸管轻轻加入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。（4）立即用0.1%SDS 液覆盖胶面（隔绝空气,有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），室温放置约40 分钟至分离胶凝固。（5）配制5%浓缩胶4ml（此步操作可在配制分离胶时同时进行）：去离子水 2.7ml30%丙烯酰胺 0.67ml1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml10%过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml10%SDS 0.04mlTEMDE（临灌胶前再加） 0.004ml（6）倒掉0.1%SDS 覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3-4 次，以洗净未聚合的丙烯酰胺凝胶（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。（7）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%积层胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，使液面至样品梳上标志线位置， 室温凝胶约40 分钟。（8）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明胶带，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。用针头式注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去除未聚合的凝胶。2样品变性及电泳（1）由-80冰箱取出提取的Hela 细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。（2）吸取细胞总蛋白样品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每样品管中分别加入5ul 4蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，98变性5 分钟，立即插入冰中，voltex 数秒，短暂离心.（3）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。（4）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶（电压约8v/cm）。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V（约12v/cm ), 继续电泳使染料至分离胶适当位置（4冰箱中进行电泳）,结束电泳。3注意事项（1）设立必要蛋白质分子量标志物（2）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性。故称量时应戴手套及口罩；（3）不同厂家的SDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用。（4）一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。（5）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;（6）在多余的样品孔中加入适量的蛋白质电泳上样液， 将会有助于保持电泳系统的平衡。（7）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正极方向流动。（8）凝胶玻璃板要定期做硅化处理: 用氯仿或庚烷配成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于180烘考2 小时。凝胶转膜及其检测凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。用于Western 印迹法的固相支持物有多种，NC（*纤维素）膜较为常用。本实验采用NC 膜作为固相支持物。转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。一、转移电泳（一） 试剂1转移缓冲液2考马斯亮蓝快速染色液(膜胶10秒钟可逆染色液 (P1601，MemStain)（二）仪器及耗材1转移电泳仪2转移电泳槽3NC 膜、剪刀、滤纸等（三）实验方法1NC 膜及滤纸的预处理：剪裁与胶大小一致的NC 膜，将其浸入1转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）2剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；3取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1转膜液漂洗一次。4转膜 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片3 层滤纸样品胶NC 膜三层滤纸（注意：排除气泡）海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80v转膜2h（此步操作宜在4冰箱中进行）。小心取出转移膜，在1TBST 液中漂洗两次用考马斯亮兰快速染液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全。（四）注意事项1.选择合适的转移缓冲系统2.为避免造成以后操作误差，在转移前将膜与胶做标记；3.将转膜夹板的负极侧放在转移电泳槽负极侧，以确保样品蛋白由凝胶转移至NC 膜。二封闭、抗体孵育及曝光（一）试剂110TBST 缓冲液2封闭液（5%脱脂奶粉）封闭专用脱脂奶粉膜快速封闭液脱脂奶粉5 克，1TBST 80ml,充分溶解后补1TBST 至100ml。3一抗： 兔抗Actin4二抗： 羊抗兔IgG/HRP5ECL 试剂盒Super ECL Plus超敏发光液 (Super ECL Plus Detection Reagent)Super ECL超敏发光液 (Super ECL Detection Reagent)BCIP/NBT片剂(碱性磷酸酶Western Blot显色底物)6显影、定影液D72显影粉D72定影粉（二）实验仪器及材料1摇床2避光盒、洗膜用平皿、X-光片、X-光片曝光盒等聚丙烯酰胺凝胶干胶装置聚丙烯酰胺凝胶干胶用透明薄膜荧光和放射自显影曝光标签是一种非同位素的自发荧光标签，可粘贴在X-线曝光暗盒内、蛋白或核酸杂交印迹膜上或包被膜的塑料保鲜膜上；曝光显影在X光胶片精确显