实验三 从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA.doc

实验三：从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段一 实验目的学习经琼脂糖凝胶电泳分离后回收并纯化DNA片段的方法二实验原理将DNA样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的DNA片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用TE缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的DNA洗脱下来。回收纯化后的DNA可直接用于DNA的连接反应、标记反应、测序反应或DNA的微量注射等研究。 三实验材料1.水浴锅、离心机、移液器2.PCR扩增的Rv1791基因3.Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 （Taraka）四实验步骤（1）实验三中的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。 （2）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。 尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 （3）切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。 （4）称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1 l进行计算。 （5）向胶块中加入3倍凝胶体积的 胶块融化液DR-I Buffer。（6）均匀混合后75加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约610min）。（7）向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。 （8）离心柱放入收集管中，将步骤7的溶液转移至离心柱中，12,000 rpm，1min，弃滤液。 如将滤液再加入离心柱中离心一次，可以提高DNA的回收率。 （9）将500 l的Rinse A加入离心柱中，12,000 rpm，30s，弃滤液。（10）将700 l的Rinse B加入离心柱中，12,000 rpm，30s，弃滤液。 （11）重复操作步骤10，将离心柱放入收集管中，12,000 rpm，1min。 （12）将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中央处加入25l的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。 注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60使用时有利于提高洗脱效率。 （13）12,000 rpm，1min，洗脱DNA。 五实验结果根据电泳结果，描述对DNA片段回收的结果与效率。M:DL2000 DNA Marker/bp44号：PCR胶回收Rv1791基因失败原因：在实验的第12步骤中将所得溶液弃置了，PCR扩增所得的DNA被弃置，导致最终没有得到DNA片段。因此电泳图上无亮条带，回收率极低，几乎无。三 思考题凝胶抽提法回收纯化DNA片段的原理是什么?将DNA样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的DNA片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后