成人骨髓基质细胞培养.doc

成人骨髓基质细胞培养更新日期：2009-07-14 点击： 姜红江孙文学鞠成朝谭训香 提要为研究成人骨髓基质细胞的体外培养及其成骨特性，将来自需取髂骨的9例患者的骨髓标本进行体外培养，传代细胞进行含10-8mmo1.L-1地塞米松的条件培养和不含地塞米松的非条件培养。倒置显微镜每日观察细胞生长情况，计数传代细胞中骨样细胞转化率，检测碱性磷酸酶含量。9例标本骨髓基质细胞培养均获得成功，条件培养后有较高的成骨细胞转化率及碱性磷酸酶活性。结果表明，成人骨髓基质细胞条件培养后，可做为临床所需的成骨种子细胞来源。 主题词骨/细胞学骨髓基质细胞培养/方法实验研究人 中图分类号：Q813.11文献标识码：A文章编号：1001-6015(2000)05-0005-02 THE CULTURE OF STROMA CELLS OF ADULT BONE MARROW Jiang Hongjiang，Sun Wenxue，Ju Chengchao （Wendeng Orthopedic-Traumatological Hospital and Institute, Shandong Province 264400） In order to study the in-vitro culture of adult bone marrow stroma cells and its osteogenic characteristics, nine bone marrow specimens from the ilia of the patients receiving iliac grafting were cultured in-vitro, and the subcultures were cultured with conditions containing 10-8 mmol. L-1 dexamesthasone (DXM) and with no conditions. The every-day growth of the cells was observed with inverted microscope, the transmission rates of the ossiform cells in the subcultured cells were counted, and the contents of AKP were measured. The bone marrow stroma cells were successfully cultured in all the nine specimens. A higher transmission rate of osteoblasts and a higher AKP activity were obtained in the culture with conditions. The results showed that the adult bone marrow stroma cells cultured with conditions may offer a source of the osteogenous seed cells for the clinical requirement. Key Words: bone/cytologybone marrow stroma cell culture/methologyexperimental studyman 骨髓的成骨作用早已被证实，临床上应用骨髓注射或复合替代材料治疗骨缺损、骨不连已取得良好疗效1。目前所知，骨髓的成骨能力来源于骨髓基质系统的基质细胞2。如果能将骨髓基质细胞在体外培养、分化后再移植，势必有良好的应用前途。关于成人骨髓基质细胞培养及成骨研究，国内尚未见报道。本实验采用成人骨髓悬液培养，对成人骨髓基质细胞体外培养及成骨特性做初步研究。 1材料与方法 1.1主要仪器及试剂1640培养液(GIBCO)，新生牛血清(上海实生细胞有限公司)，胰酶蛋白酶(GIBCO)地塞米松(江苏兴化制药厂，生产批号：970273)，CO2培养箱(TC2323，美国HELL/TB)，倒置显微镜(IX70，日本OLMPUS)，全自动显微摄像系统(PM20，日本OLMPUS)，全自动生化分析仪(AU400，日本OLMPUS)，超净工作台(IHT，济南空气净化消毒设备厂)。 1.2取材实验材料取自9例取髂骨患者，经血、尿分析无代谢性骨病。其中男6例，女3例；年龄2860岁，平均39.2岁；5例为骨不连，2例为股骨干粉碎性骨折，1例为颈椎间盘突出，1例为腰椎滑脱。术中取髂骨时，用18号腰穿针反复抽吸抽取骨髓2ml，针管预先抽取1640培养液2ml(含15%新生牛血清，青霉素100U.ml-1，链霉素100g.ml-1，氟康唑3ug.ml-1)。 1.3细胞培养将抽取的4ml骨髓悬液经80目、100目钢网过滤后，加培养液18ml稀释，接种于75ml培养瓶中，置37，5%CO2及饱和湿度条件下培养。每3天换液1次，换液时振荡培养瓶，吸除培养液，以便清除未贴壁细胞。细胞长满后，用0.25%胰酶消化，分A、B两组，以5(105.ml-1)的细胞浓度接种于7cm培养皿及50ml培养瓶中。培养皿预先放置4片盖玻片。24小时细胞贴壁后，A组换用含10-8mmol.L-1地塞米松的1640培养液，B组用1640培养液，每34天换液1次。 2培养细胞的鉴定 2.1活体相差显微观察用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况及形态变化。 2.2碱性磷酸酶(AKP)细胞化学染色分别于7、14天将生长细胞的盖玻片取出，95%乙醇固定15分钟，采用改良Gomri钙钴法3测定细胞内AKP活性。阳性细胞计数方法：每组分别计数2张盖玻片，每张于细胞多、中、少三区各取一区，每区计数500个细胞，计算出阳性细胞的百分比。 2.3AKP含量的测定于培养第7、14、21、28天取上清液2ml，全自动生化分析仪检测AKP含量。注意测AKP时，培养液换成含5%小牛血清，培养24小时后取上清。 3结果 3.1活体相差显微观察骨髓悬液于接种72小时内，以造血细胞为主。随着培养时间延长，造血细胞逐渐清除，出现梭形外观的骨髓基质细胞(图1左)，部分区域形成细胞簇。换液23次后，造血细胞基本消失，1114天后，细胞融合成单层，形态多为长梭形(图1右)。传代细胞条件培养后，增殖速度较非条件组减慢，贴壁细胞呈长梭形或大多角形，单个核，核大，12个核仁。培养2周后，细胞基本连成片，胞浆内出现均一的黑色颗粒，随着培养时间的延长，细胞聚集成团，并形成层状结构。 3.2AKP细胞化学染色经AKP孵育液及HE复染后，条件培养AKP阳性率明显高于非条件组(图2左)。阳性细胞可见灰黑色细小颗粒，有些融合成黑色块状，为AKP含量极高的细胞，明显见于条件培养2周后(图2右)。阴性细胞见胞质呈均匀一致的淡红色，无颗粒状物。9例标本2周后阳性细胞率均在85%以上(附表)。 3.3AKP含量测定条件培养组AKP检测值明显高于非条件组，分泌高峰两组均在第14天，以后逐渐下降，分泌曲线对比见图3。 附表AKP阳性细胞百分率 病例 阴性 阳性 阳性率(%) 1 216 1284 85.60 2 199 1301 86