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miRNA技术详述日期：2012-04-26 来源：未知 作者：网友 点击：730次摘要： miRNAs是一类重要的内源性小的非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达。人类基因组中大约存在超过1000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因。找产品，上生物帮 相关专题解读miRNA （MicroRNA）引述精准的基因表达调控对生物体的生长发育和功能至关重要。过去对基因表达调控的研究主要集中在转录因子介导的基因转录调控方面(激活或抑制基因转录)。而RNA一度被认为是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明RNA在生命的进程中扮演的角色远比早前的设想重要，晚近发现一系列小分子非编码RNA(small noncoding RNA)，包括miRNA (microRNA)，siRNA (small interfering RNA)，piRNA (piwi-interacting RNA)和esiRNA (endogenous siRNA)等，这些小RNA组成了RNA调控网络，在转录水平、转录后及表观遗传等水平控制基因的表达，参与调控包括细胞增殖、分化和凋亡等进程，影响着生物体的生长发育和多种病理过程。小RNA的发现也揭示了真核生物全新的基因表达调控方式。miRNAs是一类重要的内源性小的非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达。人类基因组中大约存在超过1000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因。miRNA在植物界和后生动物界间表现不同的特性。在植物中，miRNA与其靶基因通过近乎完美互补的方式相结合;而在后生动物中，经常是一条miRNA可以和靶基因的多个位点相结合，或是一条miRNA调节多种靶基因。另外,在后生生物中，miRNA靶位点位于mRNA的3 UTR，而在植物中，miRNA靶位点可以位于3 UTR，更多情况下是位于mRNA的编码区内。第一个miRNA在上世纪九十年代被发现，直到本世纪初才认识到这是一类在功能上保守的生物调节因子。在此时起，miRNA研究揭示其存在不同基因表达负调控形式，包括转录本降解和扣留(sequestering)，翻译抑制等，并可能参与了对基因表达的正调控(转录和翻译活化作用)。总之，在不同形式的细胞和组织类型中发现了不同的miRNA表达形式，miRNA可能参与了多数生理过程;并且在多种病理状态下，miRNA呈现异常表达，这些异常表达miRNA在疾病发生、发展和转归中发挥了重要作用，当前，基于miRNA的治疗方式研究当前正在进行中。miRNA的发现历史miRNA是由Victor Ambros, Rosalind Lee和Rhonda Feinbaum等人在研究lin-14基因在调节线虫发育中作用时发现的。他们发现LIN-14蛋白丰度受到一个由lin-4编码的短RNA产物的调节，来自lin-4基因的61个核苷酸前体生成一个22个核苷酸的RNA，该RNA含有与lin-14 mRNA 3 UTR部分互补的序列。这种互补特性为抑制lin-14翻译生成LIN-14蛋白的充分必要元件。然而在当时，lin-4却被认为是线虫中特有的现象而被忽视。直到2000年，第二个小RNA let-7被发现，let-7可以抑制lin-41, lin-14, lin-28, lin-42和daf-12等在发育转型中发挥重要作用基因的翻译。很快又发现let-7在多个物种间保守存在，表明在更广泛的生物物种中存在这种调节。miRNA的命名术语当前，发展了一套标准的miRNA命名系统，前缀mir后紧跟“-”和相应数字，数字通常显示名字的先后次序。而小写的mir-指pre-miRNA，如果使用大写的miR-则指成熟的miRNA。对于差别只有一到两个核苷酸的近似相同的miRNA，在命名时通常另外添加一个小写字母，例如miR-200a和miR-200b。为了区分物种来源，通常在miRNA的前面加上三个字母组成的前缀，如人源性的使用has，而绵羊(Ovis aries)来源的使用oar，其他如v表示来自病毒基因组，D表示果蝇源性的等。如果定位于不同基因组位置的前体miRNA可以生成完全一致的成熟miRNA，则通常使用外加的“-”加数字后缀来区别这种情况，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2位于基因组的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。当两个成熟的miRNA来自于相同的前体miRNA的相反的两个臂，则使用“-3p”和“-5p”后缀(过去曾使用s和as表示，分别来自sense和antisense)。当相对表达水平已知时，通常使用星号表示该miRNA在表达水平上较其对应的反向臂miRNA低。例如miR-31和miR-31*分别来自于同一前体miRNA的两对应臂，且miR-31为主要存在形式。miRNA的生物起源约40%的miRNA基因位于蛋白的内含子中或是不编码蛋白的基因序列中，甚至位于外显子中。虽有例外，它们通常呈正向分布。因此，它们多数与其宿主基因一起受到调节。另有42-48% miRNA基因呈多顺反子形式排布，虽然这并不表示这成簇分布的miRNA在结构和功能上存在相似性，但它们共用一个启动子区域，由2-7个不同的环结构经剪切加工而来。其启动子在模序结构上与由RNA聚合酶II转录的其它启动子，如编码功能蛋白基因的启动子相似。DNA模版并不是成熟miRNA的最终形式，部分人类miRNA存在RNA剪辑，位点特异的RNA序列修饰导致其产物和DNA模版不一致，从而增加了miRNA的多样性，超出了基因组模版的数量范围。miRNA的转录miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)转录生成。Pol II结合在以后形成发夹结构的颈环DNA序列附近。生成的转录本经修饰添加5帽子结构和3末端多腺苷酸尾巴结构，并剪切，生成的产物称为初级miRNA (pri-miRNA)，该产物可能长达数千或数百核苷酸，可能包含多个miRNA环结构。RNA聚合酶III (Pol III)转录生成部分miRNA，尤其是上游为Alu序列，tRNAs和哺乳动物广泛散步重复(mammalian wide interspersed repeat (MWIR)启动子单元的miRNA。miRNA的核内处理过程单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体。这些发夹结构每个由约70 nt左右的核苷酸组成。每个发卡结构附以部分序列以利于有效剪切处理。pri-miRNA中的双链发夹RNA结构被叫做DGCR8的核蛋白(DiGeorge Syndrome Critical Region 8，该蛋白与DiGeorge综合症关系密切，在非脊椎动物中称为Pasha)辨认，DGCR8同Drosha酶一起形成微处理(microprocessor)复合体。在该复合体中，DGCR8组织Drosha蛋白的RNase III结构域使其在距离发卡结构约11个核苷酸处切割pri-miRNA，使其释放发卡结构。释放的发卡结构即为前miRNA(pre-miRNA), pre-miRNA在3存在两个悬空的核苷酸，pre-miRNA 5为磷酸集团，3为羟基集团。在果蝇和线虫中存在由内含子直接剪切产生的pre-miRNA，并不经过微处理复合体过程，这种miRNA称为mirtrons。部分pre-miRNA可发生核RNA剪辑。多数情况下，作用于RNA的腺苷酸脱胺酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷(inosine)，RNA剪辑能够阻碍核内处理过程(例如导致pri-miR-142被核糖体酶Tudor-SN降解)，并改变下游处理过程，包括在胞浆的miRNA处理和靶向特异性(如在中枢神经系统中改变miR-376种子区序列)。miRNA的细胞核输出Pre-miRNA发卡通过Exportin-5蛋白的核胞浆穿梭完成从核输出到胞浆过程。Exportin-5蛋白为karyopherin家族蛋白成员，该蛋白通过辨认Drosha RNase III酶切割留下来的3两个悬空的核苷酸，介导pre-miRNA的输出，该过程由GTP提供能量完成。miRNA的胞浆处理过程在胞浆中，pre-miRNA发夹结构经RNase III Dicer切割处理。这种内源性核糖核酸酶(endoribonuclease)与发夹结构的3相互作用并在环的3和5臂上完成切割，产生长约22 nt并不完美匹配的miRNA:miRNA*双链结构。不但发夹结构和颈环的大小影响了Dicer酶切割效率，miRNA:miRNA*双链结构的不完全匹配特性也影响了Dicer酶的切割效率。虽然双链结构中的任何一条都可能成为功能miRNA，但是通常只一链可能进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，在RISC中与其相应靶基因mRNA发生相互作用。miRNA在植物中的生成情况(Biogenesis)miRNA在植物中的生成过程与在后生动物中不同，区别主要在核处理和输出过程上。与后生动物在核和胞浆中由两种不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer样酶1(Dicer-like1, DL1)完成切割处理过程。DL1只在植物细胞核中表达，表明两种反应都发生在核内。植物miRNA:miRNA*双链结构转运出核前，其3突出序列经RNA甲基化转移蛋白Hua-Enhancer1 (HEN1)甲基化修饰。而后此双链结构被Hasty (HST)由核输出至胞浆，在胞浆中解离生成成熟的miRNA，进入RISC。Hasty蛋白即为后生动物中Exportin 5蛋白的同源蛋白。RNA诱导的沉默复合体RNA诱导的沉默复合体(RISC)除了包括成熟的miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其它相关蛋白。RISC也被称为microRNA核酸蛋白复合体(microRNA ribonucleoprotein complex, miRNP)，掺入RISC的miRNA也被称为miRISC。现在认为Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联在一起的。通常情况下只有一条链进入miRISC，对双链中某一条链的偏好选择基于相对另一条链的热动力学不稳定性和更差的碱基配对能力。颈环的位置可能也影响了掺入链的选择性。不进入RISC的链被称为passenger链，其miRNA被冠以星号(*)，具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。在某些情况下，两条链都具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能miRNA。Argonaute (Ago)蛋白成员在RISC功能中处于中心地位，该类蛋白为miRNA诱导的基因沉默的必需组分，其含有两个保守的RNA结合结构域。PAZ结构域结合成熟miRNA的3序列，PIWI结构域组装核酶H (ribonuclease-H)，并与导引链(miRNA)5端结合。Ago蛋白与成熟miRNA结合使其正确朝向，以便对靶基因mRNA完成切割。一些Ago蛋白，例如人Ago2，直接切割靶转录本;另外，Ago蛋白也可能招募其它蛋白行使翻译抑制功能。在人类基因组中含有8个Argonaute蛋白，根据序列相似性分为两个家族：AGO和PIWI。AGO蛋白有4个成员，存在于所有哺乳动物细胞中，在人类这类蛋白称为E1F2C/hAgo;PIWI存在于精细胞和造血干细胞中。RISC的其它组成成分还包括TRBP human immunodeficiency virus (HIV) transactivating response RNA (TAR) binding protein，PACT (protein activator of the interferon induced protein kinase (PACT),SMN复合体，脆性X智障蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)和Tudor-SN (Tudor staphylococcal nuclease-domain-containing protein)等。miRNA介导的基因沉默模式miRNA与靶mRNA的典型作用方式主要有两种。在大多数情况下，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3 UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，从而调节基因表达。这种方式主要影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。近来，有研究对翻译抑制理论提出质疑，发现被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P小体(processing bodies，P-bodies)的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。P小体可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，减少一些特定P小体组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制作用。P小体是胞浆中的一定区域，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、无义介导mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，转录抑制及RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。另一种作用方式与siRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。以siRNA参与的RNAi为例：siRNA可与RISC结合，作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22 nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也称为转录后基因沉默(PTGS)。总之，当前认为miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用;miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。另外，miRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化，从而影响靶基因的表达。除此外，近来发现快速脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表达的新机制。在哺乳动物细胞中发现miR-125b和let-7能够促进mRNA聚腺苷酸尾巴(polyA tail)的去除。用3组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b对mRNA含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用，可见miRNA能通过降低翻译效率和聚腺苷酸化mRNA的浓度来抑制基因表达。miRNA介导的基因沉默模式机制miRNA的翻译起始抑制目前对miRNA翻译起始抑制机制主要有如下几种观点：认为miRNA可能通过抑制全能性核糖体的组装而阻断翻译起始。EIF6是一种可以抑制核糖体40S和60S亚基结合、阻断80S全能性核糖体形成的蛋白，EIF6与Ago/RISC直接相互作用，并且在哺乳动物和线虫中，缺失EIF6影响miRNA介导基因沉默。然而，RISC是否通过与EIF6相互作用诱导40S和60S核糖体解聚还有待于进一步的研究。第二种观点根据miRNA抑制要求靶mRNA m7G帽子的存在，认为miRISC可能抑制翻译起始复合物的形成。研究发现，增加体外系统中eIF4F复合物(含有m7G帽子结合蛋白、翻译起始因子eIF4E)水平可回复miRNA翻译抑制;另一个研究发现，Ago2中间结构域具有结合m7G帽子的活性，Ago2经miRNA招募到靶mRNA 3 UTR，与起始复合物eIF4E/G竞争性结合m7G帽子，抑制翻译起始复合物的形成。第三种观点认为miRNA可能通过阻止polyA结合蛋白polyA binding protein (PABP)与mRNA结合影响翻译起始。miRNA引起靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致RNA的polyA尾巴缩短，使PABP结合mRNA受阻，从而影响翻译起始。miRNA翻译起始后抑制研究发现一些被miRNA抑制的mRNA与翻译活跃的多核糖体偶联，说明这些miRNA的抑制作用不是发生在翻译起始水平。此外，经内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)起始、不依赖于mRNA m7G帽子的翻译过程也可以被miRNA抑制，证明miRNA抑制发生在翻译起始之后。虽然有如上证据，但是关于miRNA究竟如何在翻译起始后发挥抑制作用，目前还没有一致的结论。有研究者推测miRNA可能引起新生多肽链的翻译同步降解，或者是在翻译延伸过程中，miRNA能引发翻译提前终止。miRNA介导mRNA衰减miRNA可以诱导与之不完全配对靶mRNA衰减，下调靶mRNA的水平。发现Ago蛋白定位于降解mRNA的RNA颗粒(RNA granules)，如P小体中，这些RNA颗粒中包含mRNA降解酶，提示这些mRNA降解酶可能参与miRNA介导的mRNA衰减。此外，miRISC的核心成分Ago家族蛋白有多种异构体，其中一些成员的内切酶活性也可能协助miRNA介导的mRNA切割或衰减。这些证据支持miRNA可以直接或间接介导靶mRNA的降解。RNA颗粒扣押、降解或储存靶mRNA胞浆的RNA颗粒，如P小体和SG(Stress Granules)颗粒，是细胞储存处于翻译抑制状态mRNA的场所，在此，mRNA被降解或/和释放重新进入翻译机器，在转录后水平的基因表达调控中具有重要的作用。P小体被认为是细胞mRNA代谢场所;SG颗粒因特异性地在受胁迫条件下形成而得名，P小体和SG颗粒可能是miRNA胞内发挥作用的重要场所：在miRNA存在下，miRISC中的核心组分及与miRISC结合的mRNA定位于P小体和SG颗粒中;抑制P小体的形成可抑制miRNA介导的翻译抑制，抑制RISC也同样抑制P小体的形成。推测被miRISC结合的mRNA进入P小体和SG颗粒中，RNA颗粒的翻译抑制子使mRNA处于翻译抑制状态，从而实现基因沉默，靶mRNA被扣押后随即进行一个mRNA衰减或储存的分拣步骤，P小体和SG颗粒可能分工执行mRNA降解和暂时储存功能。miRNA正调控和去抑制最近的研究发现了一些新型的miRNA作用方式，如miRNA正调控和去抑制作用等。miRNA不总是基因表达的负调控因子，在一些条件下，miRNA上调基因表达。在细胞周期过程中，miRNA效应在抑制和活化作用间摆动，在G0期细胞中，miRNA活化翻译上调基因表达，而在其它时期发挥抑制作用。另外还发现一些增殖细胞中表达的mRNA 3 UTR保守性地缩短，导致miRNA的靶位点减少，从而避免miRNA负调控作用。miRNA的周期(turnover)miRNA需要快速实现周期轮转以满足miRNA表达谱快速改变的需求。当miRNA在胞浆中成熟时，Argonaute蛋白结合miRNA过程普遍被认为具有稳定引导链的作用，而同时互补的passenger链被降解消除。argonaute蛋白倾向于保留下可以调控大量靶基因的miRNAs，而清除靶向基因较少和没有任何靶基因的miRNA。在动物中，成熟miRNA的衰减由5-3外切核酸酶XRB2(又称为Rat1p)负责，在植物体内由SDN (small RNA degrading nuclease)家族成员来执行此功能，但方向相反(3-5)，在动物基因组内也编码与植物SDN酶相似的酶，但其作用还不清楚。在多种模式生物(包括拟南芥)的研究均表明miRNA的多种个修饰影响miRNA的稳定性，植物成熟的miRNA可通过3的甲基化增强miRNA的稳定性。而2-O甲基化阻止尿苷酰转移酶在此位添加尿嘧啶(该位点的尿嘧啶化和miRNA的降解有关)，同时，有观点认为尿嘧啶化具有保护miRNA的作用，因此，当前对该种修饰的确切作用还没有定论。尿嘧啶修饰不止在植物，在动物中也存在。植物和动物miRNA都可以在3发生腺苷酸修饰，例如肝脏高丰量表达miRNA miR-122，miR-122在丙型肝炎中具有重要作用，miR-122的腺苷酸修饰具有稳定miRNA的作用，在植物中的研究也发现腺苷酸修饰可以延缓miRNA的降解速率。miRNA的演化历程(进化)miRNA因其低的进化率成为重要的分类学标志物。miRNA的起源与形态进化有关，使基因表达调节更精细，更具有特异性，更有利于复杂器官的生成，并可能最终导致复杂生命的出现。事实上，形态学进化上的大爆发通常伴随了miRNA的激增。miRNA通常起源于位于DNA非编码区域随机生成的发夹结构(常位于内含子和基因间)，部分miRNA源于已存在miRNA的复制和修饰。最近起源的miRNA进化的速度(如核酸置换)与其它非编码DNA相当，暗示其通过中性漂变进化;起源古老miRNA均有很低的进化速度，通常每百万年一个碱基置换的速率都不到，表明miRNA取得一项功能经历了极其精准的选择过程。在这种情景下，miRNA很难在基因组中丢失。而最近起源的miRNA，通常可能没有重要的功能，也更容易在进化中丢失。这种特性使miRNA在进化学上成为杰出的分子标志物，可能有利于解决在分类学上存在争议的类群(如节肢动物)。miRNA是在多数真核生物中普遍存在的特性，从褐藻到后生动物都存在。到2011年3月止，已经在各个物种界共发现了15170多miRNA。虽然在细菌中没有发现miRNA，但是在细菌中同样存在短的RNA序列(通常50到数百个核苷酸长)，发挥了与miRNA相类似的功能。miRNA的识别和预测miRNA具有独特的结构和生物特性：包括miRNA前体具有发夹或折叠的二级结构，不含有大的内部环状结构和突起，成熟的miRNA位于发夹结构的颈部，由Dicer加工而成，成熟miRNA长约22 nt左右，其序列在不同物种间保守等。现今有多种发现miRNA的技术，可分为计算机软件预测和分子生物学实验方法两类。计算机分析法利用miRNA结构和构相特征预测基因组中可能存在的miRNA，然后在此基础上通过实验方法证实。随着不同生物基因组测序的完成和对miRNA结构和生化特征的深入认识，利用计算机程序对基因序列进行搜索大大提高了miRNA的鉴定效率。人们设计了多种miRNA预测软件，包括miRseeker，snarloop，MirScan等。计算机预测法的主要依据包括以下三个方面：首先，发夹结构是miRNA二级结构的基本特性，几乎所有的预测程序均将这一特征作为预测的首要标准;其次，miRNA序列和结构的保守性，这是区分miRNA候选基因和其它不相关发夹结构序列关键因素;最后，发夹结构的动力学稳定性和序列、结构的相似性等。各种预测软件在预测依据上各有侧重。MiRscan软件就是利用预测序列与已知miRNA的相似性来鉴定潜在miRNA，并对保守发夹结构进行分类，预测了多个C.elegans和人的新候选miRNAs，且通过实验得到确认。其次是根据靶标序列的保守性进行预测，靶标的3 UTRs都存在保守序列，而且这些保守序列能与miRNAs seed序列互补配对。最后，根据二级结构的热力学稳定性进行预测，利用这一特性能区别miRNAs和其它具有发夹结构的序列。miRNAs折叠的自由能比tRNAS和rRNAs低。RNAz软件为一款结合二级结构的热力学稳定性和序列保守性开发的miRNA预测软件。很多miRNAs以多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，因此利用已知miRNAs基因附近的序列来寻找潜在的miRNAs基因也是一个很有效的方法。但是，软件分析法存在一个明显的缺陷：目前对miRNAs的认识还不足以到使用计算机可以精确鉴定miRNA的程度。设置严格的检测标准将降低预测的敏感性。而较宽松的标准则其准确度会下降。其预测仅局限于在表型或序列保守的RNA，不能预测那些不具有保守性的稀有miRNA。miRNA实验检测与基因操控技术遗传学策略(genetic method)遗传学策略包括正向和反向遗传学分析。把突变的基因从产生非正常表型的生物体或者组织当中分离出来进行研究鉴定，这种研究方式为正向遗传学分析方法。第一个小非编码RNA基因lin-4在线虫中发现就是使用的这种方法。在研究时序发育混乱的突变体时，发现这种混乱是由于小非编码RNA基因lin-4发生突变造成。然而miRNA分子序列短小，对不影响seed序列的突变具有“容忍性”，都给使用正向遗传学方法研究miRNA带来困难。反向遗传学分析方法原理是在体外引入特定的突变，然后通过同型基因化或换位将突变基因导入宿主体内原来的位置，观察表型的改变。在研究miRNAs的时候，反向遗传学分析方法常常与生物信息学分析相结合，通过预测miRNA基因，然后引进突变，观察表型。基因组实验方法鉴定miRNA基因该方法需要制备小RNA的文库。现今发展了多种克隆小RNAs的实验方法，不同的小RNA克隆方法设计基本原理一致。首先将提取的总RNA通过变性PAGE胶电泳分离回收长度20-25 nt的小RNA，接着分别将5和3端接头结合于小RNA两端，RT-PCR扩增小RNA片段，获得cDNA片段后克隆入载体表达，构建cDNA文库，再通过测序分析、同源性比对确定这些小RNA的来源。在合成cDNA的第一条链时，先将3端接头接于小RNA上，为了避免小RNA和接头的自身连接，连接之前对RNA进行去磷酸化处理，对3端接头的3进行化学处理或在3端接头的5末端加上一个腺苷酸，采用T4连接酶连接，不加入ATP，这样就可以避免去磷酸化处理小RNA。3接头连接之后可进行5接头连接，连接之前最好先对其5磷酸化处理。部分扩增测序是一种PCR扩增技术，它使用一条部分覆盖miRNAs序列的引物，另一条引物为cDNA克隆的适配体。根据预测的miRNAs设计一段生物素标记的寡聚核苷酸，再用这段核苷酸去捕文库中同源的miRNAs，对被捕获的cDNA进行扩增和测序。大量已知生物的高丰度和组成性表达miRNA基因都是通过这种直接克隆而获得的。然而对于在生物体内浓度很低的miRNA，直接克隆法成效较差。miRNA表达水平的定量研究如果某种miRNA在某种特定组织、细胞或者某个发育阶段中特异性表达，说明此miRNA可能在其中发挥某种调控作用;要了解miRNA在机体中时间、空间的表达情况及其在机体生理、病理过程中所发挥的作用，必须有合适的方法检测miRNA的表达水平，在此基础上开展更深入的功能研究。现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括RNA印迹技术、原位杂交技术、微阵列技术和基于微球的流式细胞术等技术。RNA印迹技术是检测RNA的经典方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测;也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。原位杂交技术能够显示miRNA表达的位置，尤其适用于石蜡包埋或福尔马林固定后的标本，LNA特异的构造使其具有更强的杂交特性和敏感性选择性，用于原位检测miRNA是最理想的选择。微阵列技术(microarray)也称生物芯片、特点是高通量，现今广泛应用于功能miRNA的初步筛选。基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。miRNA仅为22nt左右，相当于一个引物的长度，基于PCR基础上的miRNA检测方法需通过接头增加miRNA的长度来使miRNA适于PCR扩增检测，包括有茎环引物逆转录聚合酶链反应(stem-loop RT-PCR)法、RNA加尾和引物延伸RT-PCR法等。基于扩增反应的方法还包括滚换扩增法(RCA)，引物浸入法(Invader)，测序法等。(1) Northern杂交为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。待测样本经变性凝胶电泳、转膜、烘干等步骤，使RNA牢固地结合在膜上。将膜与标记好的变性RNA探针杂交、洗膜、显影后对条带进行光密度扫描，根据条带分子大小以及密度确定miRNA表达量。但Northern技术过程烦琐，操作费力，对RNase污染非常敏感，更有难于检出表达量很低的miRNA的缺点。(2) miRNA表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。(3) 核酶保护分析技术(RPA)miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。(4) RAKE法RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。(5) 原位杂交(in situ hybridization)原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(Locked Nucleic Acid (LNA) based in situ hybridization (LNA-ISH)是当前应用较多的探针方式。(6) 实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22 nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，只简要介绍一下颈环法。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。(7) 基于padlock探针和滚环扩增的miRNA检测系统Padlock探针是线性的DNA探针，其末端序列分别可以和miRNA的两端互补杂交。在合适的条件下，当其与RNA模板匹配时，当padlock探针与靶miRNA杂交时, DNA连接酶将padlock探针的 3和5末端连接成环，其中miRNA模板随后用作滚环扩增的引物, 从而实现了对目标序列的线性扩增。padlock探针技术不需要特殊的设备，可以对纳克级总RNA中的miRNA进行检测和量化。(8) 克隆测序法大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3末端。当5端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE (miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。新一代大规模测序技术包括焦磷酸测序技术、Solexa合成测序技术和SOLID连接测序技术等，能在一次测序过程中对几百万个样本进行同时测序，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。miRNAs靶标的预测和鉴定绝大多数的miRNAs通过碱基配对的方式结合到靶mRNA的3 UTR，通过抑制靶基因的翻译达到调控基因表达的目的，因此miRNA靶标的鉴定对研究miRNA的功能至关重要。新miRNA发现的速度相对其功能研究要快的多。到目前为止，已经有15172条miRNA被收录，但是其功能研究进展相对缓慢。阻碍miRNA功能研究进展的主要原因是：miRNAs与其靶基因并非完全匹配，这给筛选miRNA靶基因带来难度;而当前缺乏高通量的实验技术是阻碍miRNA靶标鉴定进程的主要因素。miRNA与其靶基因间存在如下重要特征：靶基因3UTR区具有与miRNA 5端至少7个连续核苷酸的完全配对区域(2-8 nt)，miRNA的该部分序列称为“种子”序列;mRNA与miRNA种子序列互补的区域在物种中经常具有保守性。研究人员根据对miRNA及其靶mRNA特征的认识，开发了相应的计算机软件推断miRNA的靶基因。但多种因素影响了靶标预测的效率。miRNA靶标预测高效性影响因素最初的几个miRNAs(如let-7和lin-4)的靶标鉴定出来后，研究人员意识到miRNA与靶标转录本的3 UTRs互补配对，认为可以根据靶标和miRNA互补配对这一特点设计计算机程序进行靶标筛选。但是实践操作过程中，只依据靶标和miRNA互补配对这一原则远远不够，筛选的效率还受以下几个方面因素的制约：第一，植物的miRNA与靶标基因几乎完全配对结合，靶标基因的鉴定相对容易，但在动物中，miRNA与靶基因mRNA以不完全碱基互补配对结合于3 UTRs，给通过序列相似性来鉴定动物体内的miRNA结合位点带来了相当的困难。第二，miRNAs是序列短小的小分子，与3 UTRs结合的方式存在多样性，结合位点除了配对区还存在突环和错配区，一般的分析工具只对配对区较长，突环和错配区很少的靶标鉴定相对效率较高。第三，miRNAs存在2-7nt(seed区)与靶标精确的配对，如果忽略GC含量进行大规模seed区与已有物种的全基因组序列配对，在基因组中六个碱基随机出现的几率相对较高，预测出的靶标假阳性现象严重。第四，尽管现在很多生物的全基因组序列测序工作已经完成，但是对3 UTRs碱基序列、座位、剪接多态性认识尚浅，这也给miRNA靶基因的预测带来困难。第五，在进化过程中物种间的3 UTR序列相当保守，虽然靶标预测过程中排除那些不具有保守序列的靶标能降低假阳性概率，但3 UTR序列保守性也不是绝对的，排除所有不保守序列降低了预测的灵敏度。miRNA预测原则和软件介绍通过实验方法确定miRNAs的作用靶标非常耗时，尚无高通量的靶标鉴定方法。因此，虽然靶基因鉴定存在上述多种困难，通过理论方法预测miRNAs的作用靶标依旧是当前筛选和识别miRNAs靶标的较为理想的途径。一般情况下，用于miRNA靶基因预测的软件遵循如下几个原理：1 序列互补性：位于miRNA 5端所谓种子序列(第2-7nt)与靶基因3UTR可形成Watson-Crick配对是所有miRNA靶基因预测的最重要因素。配对包括如下几种形式：多数情况下为7nt匹配：第2-7nt与靶基因呈互补配对，外加在靶基因对应miRNA第一位核苷酸处为A(7mer-1A site)，或是miRNA第2-8nt与靶基因完全配对(7mer-m8 site);而对于miRNA第2-8nt与靶基因完全配对，且外加靶基因对应miRNA第一位核苷酸处为A(8mer site)这种类型，其特异性更高;对于仅miRNA第2-7核苷酸与靶基因完全配对(6mer site)这种方式，其用于搜索靶基因的敏感性更高，特异性相应下降。另外，还有种子序列外的3 supplementary site和3 complementary site两种形式。2 序列保守性及其它因素：除了序列互补性外，靶基因预测较关注的还包括序列保守性、热动力学因素、位点的可结合性(accessibility)和UTR碱基分布等多个因素。序列保守性：miRNA结合位点在多个物种之间如果具有保守性，则该位点更可能为miRNA的靶位点。热动力学因素：miRNA:target对形成的自由能，自由能越低，其可能性越大。位点的可结合性(accessibility)：mRNA的二级结构影响与miRNA的结合形成双链结构的能力。UTR碱基分布：miRNA结合位点在UTR区的位置和相应位置的碱基分布同样影响miRNA与靶基因位点的结合和RISC的效率。另外，诸如miRNA的分布与靶基因组织分布的相关性也是在做靶基因预测时要考虑的重要因素。用于miRNA靶基因预测的软件种类很多，包括miRanda, EMBL, PicTar, TargetScan(S), DIANA-microT 3.0, PITA, ElMMo, rna22, GenMiR+, TarBase, miRBase, miRGen-Targets等。虽然现有的几种预测程序在技术细节上有所不同，但它们预测的基本原理相似，都是基于miRNAs与靶标的结合机制。2003年，Stark和同事通过程序对黑腹果蝇全基因组搜寻鉴定潜在的miRNA靶标首先得到成功。因为黑腹果蝇全基因组序列提供了丰富而且精确的3 UTRs的信息。把果蝇的3 UTRs与拟南芥、果蝇和冈比亚按蚊的3 UTRs比对找出保守3 UTRs的序列组成一个保守的3 UTRs数据库，然后用HMMer比对搜寻工具搜寻该数据库与已知miRNA第2-8个核苷酸完全互补配对的3 UTRs序列，再用mfold软件判断miRNA靶标复合体的热力学稳定性。此方法预测出果蝇许多未知的靶标，其中有6个靶标得到实验验证。Enright等建立的miRanda法是第二个公布的miRNAs靶标预测法。其编程原理依据主要是：通过得分矩阵计算出互补程度大小，寻找互补性最高的3 UTRs;利用vien-naRNA计算miRNAs和靶标复合体热力学稳定性，并淘汰不能形成双连体的假阳性靶标。TargetScan为了在预测的开始过程排除假阳性，首先要求seed严格配对，延伸序列直到不配对的区域，然后根据保守性原则，淘汰不具有3 UTRs保守序列的分子，最后运用RNAFold进行热力学稳定性筛选。根据miRNA-靶标复合体热力学稳定性这一特性建立的预测法有PicTar、RNAHybrid等。miRNAs功能研究方法通过程序预测得到的miRNAs靶标常需通过生物学方法进行鉴定;miRNA的功能也开展详细科学的实验研究。常用的方法包括：报告基因构建，突变研究，基因沉默技术以及经典的遗传学技术。研究miRNA对靶基因的作用与一般的基因研究方法相同，上调细胞中miRNA表达水平获得gain-of-functon表型，而下调或抑制miRNA的表达获得loss-of-function表型。通过改变特定miRNA表达水平可用于鉴定受该miRNA调节的基因以及该miRNA所影响和调控的细胞反应。上调miRNA主要依靠将化学合成的miRNA导入细胞，或构建pre-miRNA表达载体转染细胞，在细胞内表达pre-miRNA并通过细胞中各种酶以及蛋白作用产生miRNA。下调则以阻断miRNA表达为主。miRNA的活性可以通过对与内源性miRNAs互补的锁核酸(locked nucleic acid, LNA)寡核酸，Morpholino(morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides)探针或2-O-甲基RNA寡核酸等技术实现。也可以通过空间位阻寡核酸在多点实现对miRNA的成熟抑制;另外，利用完全互补的antagomir可以实现对特定miRNA的沉默;Thermo旗下Dharmacon产品研发团队人工合成的miRNA模拟物和阻遏物可转染增强或者抑制内源的成熟miRNA，也是研究miRNA功能的重要的工具。miRNA转基因动物转基因技术(transgeneic technology)通过将外源DNA导入动物受精卵或胚胎干细胞内，以随机插入或同源重组的方式整合到受体染色体中，并随细胞分裂而遗传给后代。“转基因动物”对研究特定基因的功能具有重要的作用。从“转基因”表达水平上看，转基因可分为：过表达(over expression)、基因敲除(knockout，KO)及基因敲减(knockdown)等类型。因转基因导致基因表达水平明显差异，从而导致动物呈现不同表型(phenotype)，为功能实验提供重要的研究材料。以往转基因技术通过导入外源DNA片段编码酶、受体等功能蛋白质来研究相应分子的功能，随着对miRNA的研究深入，已将转基因技术普遍应用到小RNA研究中。2002