硫酸软骨素提取工艺的研究.doc

本文由cmylxjj贡献 pdf文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT，或下载源文件到本机查看。 维普资讯 第 卷第 期 年 月 生 物 学 杂 志 ， 硫 酸 软 骨 素 提 取 工 艺 的 研 究 魏 练平 ， 蒋立科 （ 安徽 农业 大学 生命 科 学 学院 ， 徽 安 摘 合肥 ） 要： 硫酸软骨素是生物界广泛存在的酸性 粘 多糖 ， 广泛存在 于动物的 器官软 骨。以猪器官软骨 为原料 ， 采用碱 提 取 和 酶 解相 结 合 的 方 法提 取 硫 酸 软 骨 素 ， 用 正 交 实 验 对 碱 提 取 过 程 中的 温 度 ， 浓 度 以及 提 取 时 间 等 三 个 关 利 碱 键 因素进行优化 ， 并对 硫酸 软 骨素成 品 的相 关指 标进 行检 测 。正交 实验 结 果表 明 ， 最佳 的碱 提取 条 件为 ： 温度 、 取 时 间 、 提 取 浓 度 为 。在 此 条 件 下 获 得 的 碱 提 取 液 ， 过 酶 解 、 色 、 沉 、 燥 ， 到 白 色 提 碱 通 脱 醇 干 得 硫 酸软 骨素 成 品 ， 总得 率 为 ， 项 指 标 均 符 合 国 家部 颁 标 准 ， 到 出 口要 求 。 各 达 关 键 词 ： 酸 软 骨 素 ； 软 骨 ； 交 法 硫 猪 正 中 图分 类号 ： 文献 标 识 码 ： 文章 编 号 ： ） （ 硫 酸软骨素 （ ， 是在生物界 广 ） 泛 存 在 的 酸 性 粘 多 糖 一糖 胺 聚 糖 （ ， 中国是一个农 牧业大 国 ， 、 、 猪 牛 羊及 其他 许多动 物 的 饲 养 量 和 屠 宰 都 位 于 世 界 前 列 ， 以 生 产 硫 酸 软 所 ） 自然界 中的硫酸 软骨 素主要分 布 于动物 的软 ， 骨、 喉骨 、 骨 、 、 中膈 和气 管 中 ， 鼻 牛 马 其他 如 腿 骨 、 韧 带、 皮肤 、 角膜等组织 中也含有。鱼类 软骨 中含量很 丰 富， 如鲨鱼骨 中含 ， 结缔组织 中含量很少 。 腔肠 动 物 、 绵 动 物 、 生 动 物 也 含 有 硫 酸软 骨 素 。 海 原 骨素 的原料来 源广泛 。据 文献报 道 ， 中国有为数 不少 的厂 家 在 生 产 硫 酸 软 骨 素 ， 技 术 上看 ， 内提 取 硫 酸 从 国 软 骨 素 的方 法 很 多 ， 括 高 压 法 ， 性 盐 法 ， 提 法 ， 包 中 碱 酶 解法等 ， 但是现行 的工艺还 比较粗糙 ， 产品多数 为粗 其 制 品， 主要在 国内使 用 ， 有少数精 制 品出 口到 国外 。 只 从经 济效益上 看 ， 制造精 品 比制造粗 制品利 润要高得 多 ， 别 是 出 口产 品 效 益 更 高 。 同 时 ， 于 疯 牛 病 ， 特 由 欧 硫酸软骨素用途广泛 ， 可用做 药物 ， 主要用在治疗 头疼 、 偏头痛的药物中 ， 可防治因链霉 素引起 的听觉障 碍及肝炎 的辅助 治疗 ， 因其 具有 降血脂 、 凝血 活性 ， 抗 也用于高血脂症 、 冠心病 、 动脉粥样硬化等 心血 管疾病 的 防治 。近 年 来 ， 着 对 其 理 化 性 质 及 生 理 功 能 研 随 究 的深 人 ， 现 还 具 有 抗 炎 、 癌 、 等 活 发 抗 抗 美 的硫酸软骨 素市场很 大部分转 移到 中国 ， 口需求 出 进一步增加 。但 是硫 酸软骨 素 的出 口要求 非 常严格 ， 而 国内许 多厂 家产品还 达不到要求 ， 主要是含 量和纯 度 问 题 ， 而 精 品 市 场供 不应 求 。 因 性， 对神经细胞 、 黏膜 细胞 、 肾细胞等具有保 护作用 ， 且 无 明显 的毒 副 作 用 。 用 鲨 鱼 硫 酸 软 骨 来 治 疗 和 预 在猪软骨 中， 硫酸 软骨素 一般与 蛋 白质 等成 分结 合在一起 形成 复合 物 ， 用碱 提取能破 坏硫酸软骨 素与 蛋 白质 之间 的键使 硫酸软骨 素释放 出来 ， 初步提取 出 来的复合物 中， 主要的杂质成分仍然 是蛋 白质 ， 其 而酶 解 可 以很 好 的去 除 杂 蛋 白 ， 高 产 品 的纯 度 。故 本 文 提 拟 以猪 器 官 软 骨 为 原 料 ， 用 稀 碱 提 取 和 酶 解 相 结 合 利 防癌症 及疑难症 ， 效果 明显 。据报道 ， 硫酸软骨素 可治 疗牛皮癣 、 减轻 关 节炎 疼 痛 、 低血 液 中胆 固 醇 的含 降 量 、 止 动物 和人 的动 脉 硬 化 ， 防 止 冠 状 动 脉 心 脏 病 防 能 发作。随着对硫酸软骨素生理功能及其生化性质 的深 入 研究 ， 已成 为流 行 的保 健 品 添 加 剂 ， 常 作 为 膳 食 它 也 补 充 剂 用 于保 护 关 节 。硫 酸 软 骨 素 是 结 缔 组 织 中 天 然 的方法提 取硫酸软骨 素 ， 希望 通过对其 制备工艺 的研 究， 获得 条切实 可行 的能够 获得符合 出 口标准 的提 取硫 酸软骨素的工艺 ， 推动 国内家畜软骨 的加 工业 ， 优 化 畜牧业产业结构 ， 增加畜牧加工产品 附加值 ， 高资 提 源利用率 。 材 料 与 方法 材 料 存在的成分 ， 能够结合水分子用于润滑和支撑关 节 ， 使 关节 活动 自如 ， 减轻关节疼痛 ， 在短期 内服用没 有明 且 显 的 副作 用 。此 外 ， 还 可 作 为 食 品 的 乳 化 稳 定 剂及保湿剂 。同时 ， 酸软 骨素在化 妆 品中 的用途也 硫 很广。 收 稿 日期 ： 一 作者简介 ： 魏练平（ 一） 女 ， ， 硕士研究生 ， 讲师 ， 主要研究 方向： 生物化学与分子生物学 ， ： ； 通讯作者 ： 蒋立科（ 一） 男 ， ， 教授 ， 主要研究方向 ： 生物化学。 维普资讯 第 卷第 期 年 月 生 物 学 杂 志 ， 猪器官软骨 ， 购于合肥肉联厂 ； 萄糖 醛酸 、 葡 咔唑 ， 公 司； 间苯三酚 ， 马斯亮蓝 ， 司 ； 考 公 胃蛋 白 酶、 胰蛋 白酶 ， 华美生物工程公 司； 牛血 清白蛋 白， 上海 第二医科大学 ； 其它试剂进 口或 国产分析纯。 型 紫外 见分 光 光 度计 ； 显 恒 可 数 温水 浴 锅 一（ 国华 电 器 有 限 公 司 ） 电子 天 平 ； （ 上海 民桥精密科学仪器有 限公 司 ） 可见分 光 ； 光度计 （ 上海精密科 学仪器有限公 司） 循环水 真 ； 空泵 一 （ 海 亚荣 生 化仪 器 厂 ） 低 速 离 心 机 上 ； 一 （ 上海安亭科学仪器厂 ） 电热恒 温鼓风干燥 ； 箱 一 上海一恒科技有 限公司 ） （ 。 实验 方 法 碱提取 ， 获得碱提取液 。 酶解 ： 将上述碱提取液冷 却至室 温 ， 调节 值 至 加入 的胰蛋 白酶 ， ， 充分搅 匀 ， 于 酶解 。 后将 酶解液用 调 值至 在添加 ， 的 胃蛋 白酶 ， 同样 于 酶解 后 ， 沸水 中进行 酶 在 的钝 化 。酶 解 完 毕 后 用 三 氯 乙 酸 除 蛋 白 ， 的 三 将 氯乙酸直接加到酶解液 中， 边加边搅拌 即产 生沉 淀 ， 将 其于 静置过夜 ， 后离心得上清液。 脱色 ： 上 清液 加 入 的活 性 碳 ， 将 于 吸附 ， 心取上清液。 离 醇沉 ： 加入 倍体积的 的乙醇 ， 于 静置过 夜， 离心所得沉 淀 ， 进行 干燥 ， 即得 到猪硫 酸软 骨素的 粉末。 硫 酸软 骨 素 的指 标 检 测 软骨的处理 将软骨投 入 恒 温蒸煮 锅 中 煮 捞起 洗 去 肉与 油脂 ， 入 一 速冻 ， ， 放 使骨 质疏松。使用前取 出 ， 入电热 干燥箱 于 烘干 放 硫酸软骨素 的得率 上述 工 艺制备 得 到 的硫酸软骨素产 品的质量 占骨粉质量的百分 比。 ， 用粉碎机粉碎成粉末状 ， 即为骨粉 。 碱提取条件的筛选 分别称取 骨粉于烧 杯 中， 加入 倍体积的蒸馏 水 ， 根据正 交试验 （ 卜 表 与表 在各 自既定 的条 件下 反应 ， 应时 间结束 后 ， ） 反 将 提取液离心取上清液 。调节 上清液 的 值 至 ， 加入 倍体积的 的乙醇 ， 静置过夜 ， 后离心 干 燥， 得 粗制品。以 的得率 以及 粗制 品中葡萄糖 含量测定 间苯三酚分光光度法， 参考文献 葡萄糖醛酸 含量的测定 参考 文献 以葡 ， 萄糖 醛 酸作 为 标 准 品 。 表 正 交 实 验 结 果 醛酸含量为指标选择最佳工艺条件 。 表 碱 提 取 正 交试 验 的 因素 与 水 平 蛋 白质 含量测定 参 照 一酚法 ， 以牛 血 清 白蛋 白为标 准 品 。 硫 酸软骨 素的澄清 度测定 将 硫酸软 骨素试 品配成 的溶液 ， 波长处 测定其吸 收度 在 （ 。 ） 硫 酸软骨 素的水分测定 烘干法 ， 取硫 酸软 骨 素的试品在 干燥 ， 测定 其减重 。 硫 酸软骨素 的 值测定 硫酸软骨素 的制备工艺 碱提取 ： 称取 骨粉 ， 加入 的碱提 取液 ， 实 验 结 果 取硫酸软骨素的试 品配制浓度为 的溶液 ， 测定其 值 。 硫酸软骨素 碱提取条 件 的筛选 碱提 取正交 实 验 如表 所示 。由表 可知 ， 浓度对 于碱 提取得 率 碱 按照上述碱提取正交试验所筛选 的最佳试验条件进 行 维普资讯 第 卷 第 期 年 月 薯 生 物 学 杂 志 “ “ “ 执 “ “ ！ 暑 ， 影 响 最 大 ， 提 取 温 度 次 之 ， 响 最 小 的是 碱 提 取 时 碱 影 可溶性肽 ， 再利用三氯醋酸可以将 蛋 白质沉淀去 除 ， 这 样有利于硫酸软骨素的醇沉 。 间。由直观 分 析 图 可 知 ， 佳 的工 艺 组 合 条 件 为 最 ， 即温度 ， 碱浓度 ， 提取时 间 ， 在此条件下 得到 的硫 酸软 骨素 的粗 制 品 的平 均 产率 为 。 影响硫酸 软骨素 得率 的因素 碱提取过程是提 高硫酸 软骨 素收率 的关键 ， 本文 利用三因素三水平的正交实验对 碱提取 过程 中的三个 重要参数 （ 温度 、 浓度 、 时间 ） 进行 了考察 ， 实验 结果表 明， 在三个因素 中， 浓度对 碱提 取率 的影响最 大 ， 碱 从 图上直观分析看 ， 随着碱浓 度的增 大 ， 提取率随之上 碱 升 ， 由于碱浓度过大可能会导致 硫酸软骨素 的降解 ， 但 故 本 文 选 用 的 最 高 碱 浓 度 为 。碱 提 取 温 度 对 于 提取量 度 碱 浓度 （ ） 碱提取率 的影响次之 ， 从直 观分 析图上看 ， 碱提取率在 时提取率最 高 ， 高于 或者 低 于 ， 提取 率 会有 所降低 。时间对于碱 提取率 影响较 小 ， 表 明当提 图 取时间到达 后 ， 着 提 取 时 间 的延 长 ， 取 率 不 再 随 提 继 续 增 加 。根 据 上 述 结 果 ， 文 选 取 最 佳 碱 提 条 件 为 本 碱提取浓度 ， 取时间 ， 取温度 。 提 提 图 碱 提 取 时 温 度 、 浓 度对 得 率的 影 响 司、 碱 ， ， 硫酸软骨素 的制备及指标检测 按 照 选 择 的工 艺 得 到 的硫 酸 软 骨 素 呈 白 所 色粉末状 ， 无臭 ， 具有较 强吸水 性 ， 易溶 于水并 成 为粘 稠溶液 ， 骨 粉共 获得硫 酸软 骨素 干燥成 品 总 ， 得率为 。其它指标 及相关标 准如表 所示 ， 由表 可见 ， 该工艺所 制备 的硫 酸软 骨素完 全 符合 部颁 标 准， 能够达 到出 口要求 。 表 硫 酸 软 骨 素 的主 要 指 标 影 响硫 酸软骨素纯度 的因素 蛋 白质 是硫 酸 软 骨 素 提 取 的 主 要 杂 质 ， 而 碱 提 故 取液的酶解 是提高硫 酸软骨素纯度 的关 键。本 文先后 采 用 胰 蛋 白酶 和 胃蛋 白 酶 对 碱 提 取 液 进 行 两 步 酶 解 ， 最终 所得 产品的纯度较 高 ， 白质含 量为 ， 到 蛋 达 国家部颁标 准。在酶解 过程 中 ， 随着 酶解 的进 行 和氨 基酸的释放 ， 反应液 的 值不 断下降 ， 应注意不 断的 调节 反应液 的 值 。 参考文献 ： 子 义 酸软 骨 素 生 产新 工 艺 海 大 学 学报 （自 华 硫 上 然 科 学 版 ） ，（ ） ， ： 庆阳 ， 徐 黎兴 荣， 石 墨， 硫酸 软骨素研 究现状 等 生 物技 术 通 讯 ， ， ： （ ） 讨 论 培城 ， 赵 高红林 ， 朱顺 达， 猪硫 酸软骨 素提 取工 艺的 等 研 究 食 品 科 技 ， ： ， ， （ ） 高 华， 刘 坤 ， 于兹 东， 间 苯 三 酚 分 光 光 度 法 测 定 等 硫酸软骨素的制备工艺原理 在猪软骨 中， 硫酸 软骨素 通过苷键 与 蛋 白质 等成 分结合 在一起 ， 碱提取 能破坏硫 酸软骨素 与蛋 白质 用 之 间的苷键使硫 酸软骨 素释放 出来并 溶解 ， 而硫 酸软 骨素分 子上 的硫 酸基较稳 定 ， 一般不会 在稀碱 条件下 分解 断裂而改变分 子大小 和结构 ， 保证 了硫酸 软骨素 的活性 。然后 ， 利用胰 蛋 白酶 和 胃蛋 白酶 可以将 溶液 硫 酸软 骨 素 的研 究 中 国生 化 药物 杂 志 ， （ ） ： 高贵珍 ， 焦庆才 ， 丁一磊 ， 天青 分光 光度 法测定硫 等 酸软骨 素含 量的研 究 光谱 学与 光谱 分析 ， ， （ ： ） 中及残 留在硫酸 软骨素上 的蛋 白质酶解 ， 形成小 分子 ， （ ， ， ） ， （ 下转 页 ） 维普资讯 第 卷第 期 年 月 生 物 学 杂 志 ， 含量急剧上 升 ， 且发 现随 着 的增加 丝绒 草 并 逐渐适应了干旱胁迫而不受伤害。这