离子液体双水相中吡罗红B 、Cu2+与牛血清白蛋白的相互作用研.doc

离子液体双水相中吡罗红 B Cu2 与牛血清白蛋白的相互作用研 Ionic liquid aqueous two phase Pyronine B Cu2 and the interaction of bovine serum albumin 摘要 建立了由亲水性离子液体溴 1 甲基 3 丁基咪唑 Bmim Br 和 NH4 2SO4构 成的双水相体系中研究吡罗红 B 和牛血清白蛋白 BSA 的相互作用 结果表明吡罗 红 B 对牛血清白蛋白有静态猝灭作用 由计算出的热力学参数 表明吡罗红 B 与牛 血清白蛋白主要结合作用力为静电作用力 并利用同步荧光研究了吡罗红 B 对 BSA 的构象的影响 研究了其它金属离子对 BSA PB 体系的影响 其中 Cu2 对体系的 影响是最大 因此 又进一步研究 Cu2 对 BSA 的影响及吡罗红 B 对 BSA Cu2 体系的 影响 关键词 离子液体 离子液体双水相 牛血清白蛋白 吡罗红 B 荧光猝灭 Established by the hydrophilic ionic liquid 1 methyl 3 butyl imidazolium bromide Bmim Br and NH4 2SO4 aqueous two phase system composed of using this to study the Pyronine B and bovine serum albumin BSA of each other effect The results show that the Pyronine B on bovine serum albumin BSA has a static quenching effect By the calculated thermodynamic parameters infer the role of electrostatic and hydrophobic is Pyronine B and bovine serum albumin the major binding forces Pyronine B on the influence of BSA s Conformation Pyronine B and bovine serum albumin to form a 1 1 complex And using synchronous fluorescence to study with Pyronine B on the conformation effects of BSA Of metal ions to bovine serum albumin the impact of Pyronine B Which Cu2 is the biggest impact on the system Further therefore And study Cu2 on the BSA s affected Study Pyronine B on the impact of BSA Cu2 Key words ionic liquids ionic liquid aqueous two phase bovine serum albumin Pyronine B fluorescence quenching of BSA 1 19 2020 第 2 页 共 12 页 2 目目目 录录录 1 引言 3 2 实验部分 3 2 1 仪器和试剂 3 3 3 3 结果与讨论结果与讨论结果与讨论 3 3 13 13 1 荧光猝灭机制荧光猝灭机制荧光猝灭机制 3 3 23 23 2 结合常数结合常数结合常数 K K K a a a 和其结合点数和其结合点数和其结合点数 n n n 的确定的确定的确定 5 3 33 33 3 吡罗红吡罗红吡罗红 B B B 与与与 BSABSABSA 结合力类型的确定结合力类型的确定结合力类型的确定 6 3 4 吡罗红 B 对 BSA 构象的影响 7 3 53 53 5 加入不同金属离子对 BSA PB 体系的影响 8 3 63 63 6 Cu2 对 BSA 的影响和吡罗红 B 对 BSA Cu2 体系的影响 10 4 4 结论 13 参考文献 13 1 19 2020 第 3 页 共 12 页 3 一引言 离子液体 是在室温附近呈液态 一般由有机阳离子和无机阴离子结合组成的盐 类化合物 也称为低温熔融盐 其主要特点是没有明显的蒸汽压 热稳定性化学稳 定性好 双水相 是指某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相 并且在两相中水分均占很大比例 即形成双水相 荧光猝灭 是由荧光物质分子与溶 剂分子之间所生导致的荧光强度变化或相关的激发峰位变化或荧光峰位变化的物理或 化学作用过程 离子液体双水相是在一定 pH 值下的离子液体中加入无机盐所产生分 层的现象 本实验中采用 Bmin Br 和 NH4 2SO4形成的离了液体双水相体系 本试 验研究了在不同温度下的离子液体 Bmin Br 双水相中吡罗红 B 对牛体血清白蛋白的 作用为静态猝灭过程 从计算结果 吡罗红 B 与牛血清白蛋白的结合常数 结合比和 结合过程中的热力学参数 H S G 得出吡罗红 B 与牛血清白蛋白之间的作用 力主要是疏水作用和静电作用 并且讨论了 Cu2 Mn2 Zn2 Mg2 和 K 各金属离 子加入 PB BSA 体系对体系的影响和深入探讨 Cu2 对 BSA 的影响和 PB 对 Cu2 BSA 影响 二 实验部分 1 仪器和试剂 TU 1901 双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司 RF 5301PC 荧 光仪 日本岛津 FA1104 电子天平 上海良平仪器仪表有限公司 牛血清白蛋白 BSA 1 0 10 5mol L 吡罗红 B PB 1 0 10 4mol L Tris HCl pH 7 4 缓冲溶液 离子液体的制备按指定方法制备 Cu2 Mn2 Zn2 Mg2 K 1 0 10 2mol L NH4 2SO4 无水 本实验所用试剂都为分析纯 所有用水均为去离子水 2 实验方法 1 在 15ml 刻度比色管中分别加入 1ml PH 7 4 Tris HCl 缓冲溶液 1ml 离子液体 和一定量的 BSA 和 PB 加水定容到 5ml 后加入 2 0g NH4 2SO4振动溶解 静止 分层 取上层溶液于其它比色管中加水定容到所需体积并摇匀 待反应 15 分钟后用 1cm 荧光比色皿 固定激发波长 280 nm 发射与激发狭缝均为 5 nm 用荧光分光光度 计测其荧光发射光谱再用 1cm 石英比色皿 以水作参比 测其紫外吸收光谱 2 在 15ml 刻度比色管中分别加入 1ml Tris HCl 1ml 离子液体和一定量的 BSA Cu2 和 PB 都加水定容到所需体积 后加入 2 6g NH4 2SO4振动溶解 静 止分层 取上层溶液于其它比色管中加水定容到所需体积并摇匀 待反应 15 分钟后测 1 19 2020 第 4 页 共 12 页 4 其荧光光谱和紫外吸收光谱 方法同上 三 结果与讨论 3 1 荧光猝灭机制 蛋白质分子因含有三种芳香族氨基酸色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸而产生较强的内源 性荧光 当某些小分子与 BSA 结合后 会导致其荧光强度下降 这种现象称为荧光猝 灭作用 根据实验方法测得吡罗红 B 与牛血清白蛋白的荧光光谱如图 1 所示 图中 6 7 分别为纯离子液相中和离子液相中 PB 在所测范围内没有荧光峰 图 1 中 1 为 离子液相中单纯 BSA 的荧光光谱 实验中固定 BSA 的浓度 在其中加入不同浓度的 PB 随着 PB 浓度的增加 BSA 的荧光强度逐渐降低 表明 PB 与 BSA 之间发生了作 用 发生了荧光猝灭现象 300350400450500 0 70 140 210 280 A nm 1 7 图 1PB 与 BSA 的荧光猝灭光谱图 Fig 1 Pyronine B and the fluorescence quenching spectra of BSA 1 5 CBSA 1 0 10 6 mol L 1 CPB 1 0 10 6 mol L 1 0 3 6 12 15 6 纯 离子液相中 7 CPB 1 0 10 6 mol L 1 引起 BSA 荧光猝灭的原因可能有动态猝灭或静态猝灭 动态猝灭是猝灭剂和荧光物 质的激发态分子之间的相互作用过程 静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子相互作用生 成不发荧光的缔合物 从而导致荧光物质荧光强度降低的过程 动态猝灭过程遵循 Stern Volmer 方程 F0 F 1 Ksv Q 1 Kq 0 Q 1 其中 F0为未加猝灭剂时的荧光强度 F 为加入猝灭剂后的荧光强度 Ksv 为动态猝 灭常数 0为没有猝灭剂存在时的荧光分子的平均寿命 Kq 为猝灭的速率常数 Q 为 猝灭剂浓度 静态猝灭过程可用下式表示 1 F0 F 1 F0 1 KF0 Q 2 即 F0 F 1 K Q 2 1 其中 F0为未加猝灭剂时的荧光强度 F 为加入猝灭剂后的荧光强度 K K 即 Ka 是基态配合物的形成常数 1 19 2020 第 5 页 共 12 页 5 从 1 和 2 1 可知 无论是动态猝灭还是静态猝灭 F0 F 与 Q 都有线性关系 由 F0 F 与 Q 作图 如图 2 所示 图 2 不同温度下 PB 对牛血清白蛋白的 Stern Volmer 曲线 Fig 2 Stern Volmer curves of BSA by Pyronine B under different temperatures 1 25 2 35 表 1 PB 和 BSA 用参数 Table1 Pyronine B and bovine serum albumin interaction parameters T KKsv L mol Kq L mol s Ka L mol 2988 394 1048 394 10125 8018 105 3086 472 1046 472 10124 4180 105 各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数为 2 0 1010L mol s 1 从表 1 可 知 BP 对 BSA 荧光的猝灭过程速率常数都大于最大扩散控制的速率常数 初步判断 此猝灭过程为形成复合物的静态猝灭 静态猝灭过程 Ksv 会随温度的升高而降低 由 表 1 可知与本实验中正相符 进一步说明 PB 对 BSA 的猝灭过程是静态猝灭过程 3 2 结合常数 Ka和其结合点数 n 的确定 在静态猝灭中有 log F0 F F logKa nlog Q 3 由 3 作图如图 3 可得 Ka和 n 如表 2 所示 5 6 5 5 5 4 5 3 5 2 5 1 5 0 4 9 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 0 1 lg F0 F F lg Q 1 2 1 19 2020 第 6 页 共 12 页 6 图 3 不同温度下吡罗红 B 对牛血清白蛋白的 Linewaver Buck 曲线 Fig 3Linewaver Buck curves of BSA by Pyonin B under different temperatures 1 25 2 35 表 2 2 静态猝灭方程和相关系数 R 及结合位点数 n Table2 Static quenching equation and correlation coefficient r and the number of binding sites n T KRegression equationRn 298log F0 F 1 5 76356 1 18034log Q 0 994541 18034 308log F0 F 1 5 64523 1 19626log Q 0 995801 19626 根据实验结果 可知 PB 对牛血清白蛋白之间有一定的结合作用 在 298K 和 308K 的条件下它们形成了一个结合位点 吡罗红 B 同牛血清白蛋白形成 1 1 的复合物 温 度升高结合比有所升高 说明生成复合物随温度升高而稳定 3 3 PB 与 BSA 结合力类型的确定 由热力学公式 lnK2 K1 H 1 T1 1 T2 R 4 G H T S RTlnK 5 求出热力学数据如表 3 表 3 热力学参数 Table3 Thermodynamic parameters T K H kJ mol S J K G kJ mol 298 130 72747 480 14 279 308 130 72746 510 14 456 反应 G 0 从热力学角度分析 PB 与 BSA 结合反应能够自发进行 反应的 H 0 为放 热反应 小分子和蛋白质等生物大分子的结合主要有疏水作用力 氢键 范德华力和 静电引力等 由表 3 可以看出反应的焓变 H0 可以判断其相互作用 力主要为静电作用力 3 4 吡罗红 B 对 BSA 紫外吸收光谱的影响 300400500600 0 0 0 4 0 8 1 2 A nm 1 2 34 1 19 2020 第 7 页 共 12 页 7 图图 4 PB 与 BSA 相互作用的紫外吸收光谱 Fig4 UV visible absorption spectra of PB BSA and Pyronine B interaction with the BSA synchronous CBSA 1 0 10 6 mol L 1 CPB 1 0 10 6mol L 1 1 BSA PB 2 PB 3 BSA 4 纯纯离子液相中离子液相中 由图 4 可知 PB 的加入使 BSA 的吸光度明显增强 并在 347 和 533nm 处有新 的吸收峰 而单纯的 BSA 在此两处均没有吸收峰 表明 PB 和 BSA 发生了相互 作用 3 5 吡罗红 B 对 BSA 构象的影响 蛋白质的荧光主要是色氨残基酸 酪氨酸残基 可利用同步荧光光谱法来分析 PB 对 BSA 的构象的影响 当 15 时 同步荧光光谱显示酪氨酸残基的特征荧光 当 60 时同步荧光光谱显示色氨残基酸的特征荧光 而色氨残基酸 酪氨酸残基的最 大发射波长与它们各自所处的微环境直接有关 所以可根据 15 的同步荧光光谱 和 60 的同步荧光光谱来研究 BSA 的构象变化的情况 300350 0 20 40 60 80 100 F nm 1 5 图 5 PB 与 BSA 相互作用的同步荧光光谱 15 Fig5 Pyronine B interaction with the BSA synchronous fluorescence spectroscopy 1 5 CBSA 1 0 10 6 mol L 1 1 5 CPB 1 0 10 6mol L 1 0 3 6 12 15 300350400 0 100 200 nm F 1 5 1 19 2020 第 8 页 共 12 页 8 图 6 PB 与 BSA 相互作用的同步荧光光谱 60 Fig 6 Pyronine B interaction with the BSA synchronous fluorescence spectroscopy 1 5 CBSA 1 0 10 6 mol L 1 1 5 CPB 1 0 10 6mol L 1 0 3 6 12 15 从图 5 图 6 可知 当 BSA 的量一定时 随吡罗红 B 浓度的增加酪氨酸和色氨酸残基 荧光强度不断降低 酪氨酸和色氨酸残基的最大发射波长没有明显的移动 说明 PB 的加入对 BSA 的构象影响不大 3 6 加入不同金属离子对 BSA PB 体系的影响 200400600 0 0 0 8 1 6 A nm 7 6 5 4 3 2 1 图 7 不同金属离子与 BSA PB 的紫外可见吸收光谱 Fig7 Different metal ions and BSA Pyronine B UV visible absorption spectra CBSA 1 0 10 6mol L 1 CK CMn2 CMg2 CZn2 CCu2 1 10 3mol L 1 CPB 1 0 10 5mol L 1 1 BSA 2 BSA PB 3 BSA PB Mn2 4 BSA PB K 5 BSA PB Mg2 6 BSA PB Zn2 7 BSA PB Cu2 1 19 2020 第 9 页 共 12 页 9 300350400450 0 100 200 300 400 500 nm 1 7 F 图 8 不同金属离子对 BSA PB 的荧光光谱 Fig 8 Different metal ions and BSA Pyronine B fluorescence spectra CBSA 1 0 10 6mol L 1 CK CMn2 CMg2 CZn2 CCu2 1 10 3mol L 1 CPB 1 0 10 5mol L 1 1 BSA 2 BSA PB Mg2 3 BSA PB K 4 BSA PB Mn2 5 BSA PB Zn2 6 BSA PB 7 BSA PB Cu2 由图 7 可知 Cu2 Mn2 Zn2 Mg2 和 K 各金属离子的加入均使 BSA PB 体系的 紫外可见吸光度增强 Cu2 的加入吸光度增强更明显 由图 8 可知 Mn2 Zn2 Mg2 和 K 的加入使 BSA PB 体系的荧光强度增强 而 Cu2 的加入使 BSA PB 体系的荧光强度明显降低 而且最大发射波长有明显蓝移现象 说明 Cu2 对 体系的影响相对较强 3 7 Cu2 对对 BSA 和和 PB 对对 BSA Cu2 体系的影响体系的影响 Cu2 Mn2 Zn2 Mg2 和 K 的加入 使 BSA PB 体系的吸光度增强 除 Cu2 以 外 其它金属离子对体系的荧光强度有增敏的作用 其中 Cu2 的加入对体系影响 最大 而且使体系荧光明显猝灭 而且使体系的最大发射波长蓝移 本文又深入地讨 论 Cu2 对 BSA 和 PB 对 BSA PB 体系的影响 1 19 2020 第 10 页 共 12 页 10 300350400450 0 100 200 300 400 500 F nm 1 7 图 8 Cu2 与 BSA 作用的荧光光谱 Fig 8 Cu2 and BSA fluorescence spectroscopy CBSA 1 0 10 6mol L 1 1 7 CCu2 1 0 10 3 mol L 1 0 3 6 9 12 15 18 由图 8 可知 Cu2 对 BSA 有荧光猝灭作用 荧光猝灭随 Cu2 的浓度增加而加强 最 大发射波长明显蓝移 说明 Cu2 与 BSA 相互作用形成复合物 300350400450500 0 100 200 300 400 500 600 F nm 10 1 图 9 PB 与 BSA Cu2 体系作用的荧光光谱 Fig 9 Pyronine B and BSA Cu2 system fluorescence spectra 1 8 CBSA 1 0 10 6mol L 1 2 8 CCu2 5 10 4mol L 1 CPB 1 0 10 6mol L 1 0 3 6 9 12 15 18 9 CCu2 1 10 3mol L 1 10 CCu2 1 10 3mol L 1 CPB 1 0 10 5mol L 1 如图 9 所示 9 为 Cu2 没有荧光峰 而且 PB Cu2 体系也没有荧光峰 由 2 与 3 8 比较 可知当固定 BSA Cu2 的量 随 PB 浓度的增加体系荧光强度不断降 低 并且峰位蓝移 说明 PB 与 BSA Cu2 体系形成了复合物 发生了静态猝灭 现象 1 19 2020 第 11 页 共 12 页 11 300400500600 0 0 0 3 0 6 0 9 1 2 1 5 A nm 1 2 3 4 5 6 7 图 10 吡罗红 B BSA Cu2 的紫外可见光吸收光谱图 Fig 10 Pyronine B BSA Cu2 UV VIS absorption spectra CBSA 1 0 10 6mol L 1 Cu2 1 10 3mol L 1 CPB 1 0 10 5mol L 1 1 BSA Cu2 PB 2 BSA Cu2 3 BSA PB 4 Cu2 PB 5 PB 6 BSA 7 Cu2 如图 10 所示 5 6 7 分别是 PB BSA Cu2 紫外可见吸收光光谱 由 3 2 可知 PB 和 Cu2 的加入使 BSA 的吸光度增强 由 2 6 7 可知 在波长为 350nm 和 534nm 处 BSA Cu2 BSA Cu2 均没有吸收峰 而 PB 在此均有吸收 峰 由 1 可知 PB 的加入使 BSA Cu2 体系的吸光度明显增强而且峰位明显蓝移 并在 350nm 和 534nm 处有新的吸收峰 表明 PB 和 BSA Cu2 发生了相互作用 4 结论 本文研究结果表明 吡罗红 B 和牛血清白蛋白相互作用形成复合物 引发静态猝灭 依据热力学参数与作用力的关系确定吡罗红 B