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生化与分子生物学实验讲义天津医科大学生物医学工程系2005年实验一 自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA一、实验目的 1、了解核酸的基本特性。2、掌握DNA提取和鉴定的方法。二、实验原理核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA为双链线性分子，存在于细胞核内。基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。分离纯化核酸的总原则：1、 保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。2、 排除其它分子的污染。a) 对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。b) 生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。c) 其它核酸分子：RNA.三、实验试剂 1、TKM缓冲液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷）10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl2 2、TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.0 3、10SDS 4、饱和氯化钠四、实验步骤1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。2、加入0.5ml TKM缓冲液，13l Triton X-100（终浓度为1.2），颠倒混匀。在台式离心机上离心，5,000rpm10分钟。（低渗破红细胞膜）。3、 倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm10分钟，重复步骤3两次。（清洗）4、于沉淀中加入200l TKM缓冲液和15l 10SDS（终浓度为0.7），混匀后于55保温20分钟。（破白细胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。5、于离心管中加入75l 饱和（6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为1.2 mol/L），混匀。13,000 rpm离心5分钟。（沉淀蛋白质）6、小心吸取上清液约240l转移至另一洁净的1.5ml Eppendorf离心管中。加入750l 95的冷乙醇（终浓度为71），80放置30min。离心1,5000 rpm20分钟，最好在4。（沉淀DNA）7、小心吸去上清，加入1.0 ml 75的冷乙醇，洗涤沉淀，相同条件再离心一次。（脱盐）8、弃去上清，用Parafilm膜封口，在膜上扎孔后置37温箱中干燥，以去除残余的乙醇。9、将干燥后的DNA溶于50l TE缓冲液中，置20冰箱中备用；也可将干品置20冰箱中备用，使用前用30l重蒸水溶解。10、 OD260/OD280的测定。五、注意事项为保证核酸分离的完整性和纯度，实验过程中应注意以下事宜：1、 量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。2、 少化学因素对核酸的降解，避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏。3、 减少物理因素的核酸的降解，如机械剪切力（强力高速的震荡）、高温（破坏化学键，常规操作温度为04，可降低核酸酶的活性，减少核酸的生物降解）。4、 防止核酸的生物降解，核酸酶消化磷酸二酯键，破坏一级结构。其中DNA酶，需要二价金属离子的激活（Mg2），使用二价金属离子鳌合剂EDTA，基本上可抑制DNA酶的活性。实验二 聚合酶链式反应及DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、掌握PCR反应的原理，学习PCR的方法，熟悉PCR扩增仪的使用。2、了解PCR反应条件的优化及引物设计。3、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是Karry Mullis于1985年创立的一种通过体外酶促扩增获取大量特异DNA片段的方法。PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应，模拟天然DNA的复制机制。PCR的特异性取决于引物和模板的特异性结合。PCR的全过程是以变性、退火、延伸三步反应为一周期，通过若干轮的循环完成的，其中每一步的转换是通过改变反应温度来控制。1、变性（denaturation） 模板DNA在95左右的高温条件下双链间的氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中。2、退火（annealing） 热变性后将温度降低，人工合成的两个寡核苷酸引物分别与模板DNA扩增区域的两端准确配对结合，形成局部杂交链。3、延伸（extension）在四种dNTP底物及Mg2存在的条件下，DNA聚合酶在最适作用温度下可将脱氧单核苷酸从引物3端掺入，并沿着模板以新合成的DNA单链的53方向延伸合成新DNA，以上三个步骤为一循环，每一循环的产物可作为下一循环的模板。如图所示，理论上PCR合成的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n的指数方式递增。PCR经30轮循环后，PCR扩增量应达到230个拷贝，约109个拷贝，但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片断的序列及反应体系的条件等诸多因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106107个拷贝。三、实验流程1、目的基因的PCR扩增2、PCR产物的电泳检测四、实验试剂1、Taq DNA聚合酶：5 U/l。2、dNTP：4种dNTP按等比例混合，每种2.5mmol/L。3、MgCl2：，与缓冲液混在一起，无需单独配置。4、PCR引物：稀释为一定的浓度，扩增时用量为12l反应体积。5、缓冲液：10PCR缓冲液浓度如下，使用时按比例稀释：250500mmol/L KCl100500mmol/L Tris-Cl （pH 8.4）0.5% Tween-201mg/L BSA6、琼脂糖凝胶：根据待分离样品分子质量的大小选择不同浓度的凝胶。7、溴化乙锭（10mg/ml）在20ml双蒸水中溶解0.2g溴化乙锭，混匀后4避光保存，溴化乙锭是一种诱变剂，操作时应注意安全。8、上样Buffer： 0.25的溴酚蓝，使用时需加入一定浓度的甘油或蔗糖聚蔗糖，以使样品沉入加样槽。五、实验步骤1、PCR反应体系总体积25l（10buffer 2.5l，Mg2+ 1.5l，ddH2O 13.5l，primer A 2l，primer B 2l），模板DNA 1l，Taq酶1.5l）。 2、循环参数设定（1）95 1min 62 1min 72 1min 72延伸7min（2）反应体系终止后。2琼脂糖电泳（溴化乙锭染色）a、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。b、根据核酸分子质量的大小配置不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200400bp的DNA片段，可配置1.21.7浓度的琼脂糖用于电泳。c、在锥形瓶中配置0.5TAE电泳缓冲液100ml，称取一定量的琼脂糖粉放入沸水浴中或微波炉内加热熔化。冷却至60（需要时可加入溴化乙锭），倒入电泳槽中，待凝固。d、向电泳槽中倒入配置好的凝胶，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。e、 在DNA样品中加入0.2体积的上样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。f、接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。电压为15V/cm（长度以两个正极之间的距离计算）。g、根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200400bp的PCR产物50V电压，电泳2040分钟即可。h、溴化乙锭染色后，紫外灯上观察电泳带的及其位置，并与标准分子质量核酸比较扩增产物的大小。实验三 质粒的提取一、实验目的1、学习质粒DNA的基本知识。2、掌握质粒的小量快速提取法。二、实验原理 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1200kb之间，具有双链闭合环状结构。主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，表达它携带的遗传信息。质粒可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，它所控制的许多生物学功能也赋予宿主细胞某些特殊的表型。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）也可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用乙醇沉淀，即可得到质粒DNA。质粒DNA分子量一般在106107道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中可能呈现3条区带。三、实验仪器及试剂1、仪器与耗材微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。2、材料大肠杆菌DH53、试剂（1）pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）。 （2）pH 4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/L KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml H2O）（3）酚/氯仿（11，V/V）：酚需在160重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（241，V/V）。（4）pH 8.0 TE缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20g/ml。（5）TAE缓冲液：称取Tris10.88g、醋酸5.52g和EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200ml，用前稀释10倍。四、实验步骤1、细菌的培养、质粒DNA的扩增和收集：（1）挑取琼脂平板上的单一菌落，接种至20ml LB液体培养液中，37，300转/分振摇过夜。（2）取1ml上述菌液于1.5ml Eppendorf管中，6000转/分离心3分钟，弃上清并重复1次，共收集2ml菌液。（3）倒掉菌液上淸，将Eppendorf管倒置于滤纸上空干，同时配置溶液。2、细菌菌体的裂解和初步纯化：（1）在上述Eppendorf管中加入冰浴后的溶液100l，剧烈振荡混匀。（2）加入室温放置的溶液200l，颠倒混匀，此时溶液会变澄清，冰上放置3分钟。（3）加入冰浴后的溶液150l，颠倒混匀，此时溶液中会出现絮状沉淀。12000转/分离心5分钟，将上淸移至另一干净1.5ml Eppendorf管中（约有400l）。（4）每管加等体积的“酚：氯仿”（下层有机相），剧烈震荡混匀后12000转/分离心5分钟，将上淸液移至另一干净1.5ml Eppendorf管中（约300l）。（5）每管加入2.5倍体积95乙醇（600l）室温静置30分钟后12000转/分离心5分钟。（6）倒掉上淸后将管底倒置于高压过的滤纸上控干。（7）加入50l TE（含无DNA酶的RNA酶20l/ml）溶解质粒DNA，短暂震荡5分钟后，可进行内切酶实验或20存储。3、电泳鉴定空质粒载体大小位置1琼脂糖电泳鉴定质粒大小位置，观察没有经过酶切的质粒是否有松弛环状质粒DNA、线性质粒DNA及超螺旋状态质粒DNA上下三条带出现。附：DNA的琼脂糖凝胶电泳：1、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的基本方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB）染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。 琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度的凝胶。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。琼脂糖主要在DNA电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定： （1）DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移越慢。 （2）琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度线性DNA分子的分离范围0.30.60.70.91.21.512.05601200.8100.570.960.230.12（3）DNA分子的构象 分子量相同，构象不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带，难以确定是质粒DNA不同构象引起，还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 （4）电源电压 在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 （5）嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15。 （6）离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成浓缩母液，储于室温。 （7）制备步骤a、琼脂糖凝胶的制备：称取0.6g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 ml TAE缓冲液，经沸水浴加热全部融化后，取出摇匀，此为1.2%的琼脂糖凝胶。b、胶板的制备：取橡皮膏（宽约1cm）将有机玻璃板的边缘封好，水平放置，将样品槽板垂直立在玻璃板表面。将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30 min，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。用滴管将样品槽内注满TBE缓冲液以防止干裂，制备好胶板后立即取下橡皮膏，将胶板放在电泳槽中使用。c、加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。d、加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在6080V，电流为4050 mA。当指示前沿移动至距离胶板12cm处，停止电泳。e、将电泳后的胶板在EB染色液中进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。实验四 限制性核酸内切酶分析及DNA的回收一、实验目的1、 了解限制型核酸内切酶的性质及酶切反应的条件。2、 掌握DNA回收的方法。二、实验原理1、限制性内切酶的反应条件 a、缓冲系统：多数生物技术公司的产品目录中均提供了关于何种酶适合于何种缓冲液的资料。为了简化操作，有人提出了“通用缓冲液”的反应体系，组成如下：Tris-HCl 50 mmol/L pH8.0MgCl2 10 mmol/L二硫苏糖醇（DDT） 1 mmol/L牛血清白蛋白 100g/mlNaCl 0g/L （低盐缓冲液）NaCl 50g/L （中盐缓冲液）NaCl 100g/L （高盐缓冲液）b、反应体积：一般不少于20l，过少的反应体积在加入各种组分时，容易产生误差。商品化的限制性内切酶溶液中含有50（V/V）的甘油作为防冻剂，酶切体系中酶的用量不宜超过总体积的1/10，因为甘油含量若超过5，则会抑制内切酶的活性。 c、反应温度：大多数常用的反应温度为37，相当一部分酶在反应温度升高时不稳定。d、反应时间：由于商品形式提供的限制性内切酶只是相对纯的制剂，并不是绝对不含其它杂酶，若反应时间过长，有可能出现杂酶活力。因此，在使用时要避免长时间的酶解反应，一般可选择11.5h，最长不要超过3h。2、影响限制性内切酶酶解反应的因素a、DNA纯度：纯度越高，酶解效率越高。b、DNA分子的结构和构型：环状、超螺旋DNA分子的酶切率，线性DNA分子，甲基化修饰作用可以阻碍DNA分子的切割。c、反应体系：缓冲体系、pH值，Mg2浓度、NaCl浓度。d、温度和时间：一般为37，在保证酶切效率的前提下尽量避免长时间反应。e、酶及酶量：选用高质量制剂，不要高浓度的酶，防止杂酶活性产生。3、限制性内切酶的应用方法 a、小量酶解反应：主要用于质粒的酶切鉴定，典型的反应是20l体积中含0.21.0g DNA。 b、大量酶解体系：主要应用于大量制备基因片断，一般反应体积在50100l，DNA用量在1030g。三、实验仪器及试剂（一）仪器 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。 （二） 试剂 1、5TBE电泳缓冲液。2、6电泳载样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4。 3、溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。 四、实验步骤（一）DNA酶切反应 1、将清洁干燥并经灭菌的Eppendorf管(最好0.5ml)编号，用移液器分别加入DNA1g和相应的10限制性内切酶反应缓冲液2l，再加入重蒸水使总体积为19l，将管内溶液混匀后加入1l酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机短暂离心一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后，将Eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。 3、每管加入2l 0.1mol/L EDTA（pH8.0），混匀或加热，以终止反应，置于冰箱中保存备用。 （二）琼脂糖凝胶电泳1、加样：取10l酶解液与2l 6载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 2、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。 五、注意事项1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg 1DNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不像l DNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。 4、观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光切割DNA。 5、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6、当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察点击排行。【附录】1、限制性核酸内切酶作用及分类限制性核酸内切酶（以下简称限制性酶）是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA的磷酸二酯键，产生5-P和3-OH末端。1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。Arber及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自已的DNA并不降解，据此他们提出了限制- 修饰酶假说。对于一个宿主细胞，限制性酶及DNA甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对DNA底物可以有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子内部拆卸水解，甲基化酶是对所识别DNA分子的修饰，经修饰后就可逃避限制性酶的识别及切割。甲基化酶只修饰宿主自身的DNA，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。 限制性酶主要分为三种类型：型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在DNA链上没有固定的切割位点，一般在离识别位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。型酶与型酶基本相似，不同的是型酶在识别位点之外，有特异性的切割位点，但这两类酶对DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸序列，产生特异性的DNA片段。2、识别序列及消化产物的末端结构限制性内切酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称迴文序列，如EcoRI的识别序列为： GAATTC CTTAAG这种结构又称为双重对称结构。G表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。4核苷酸序列在DNA链中出现频率高，对一随机排列的DNA分子来说，出现几率为1/44，因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多，产生片段的数目多，长度短。对于5和6核苷酸识别序列的酶，出现频率分别为1/45和1/46 ，因此，6核苷酸的特异性序列在DNA中出现频率低，而8核苷酸识别位点在DNA链中出现机率更低(1/48 )。一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列，其迴文识别序列被一个或几个其它核苷酸所间隔，如Bgl的识别序列是： AGATCT TCTAGA另外有些限制性酶(约10种，如BbV等)，其识别序列不表现为迴文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。 限制性酶切片段的末端结构：限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割DNA链时，总是水解核苷酸3和5-磷酸二酯键的3位磷酸酯键，使产物的5端带磷酸单酯基团，而3末端则为游离羟基。一种酶的全部水解产物具有相同末端的结构。根据酶解产物的结构特点，产物的末端可分为粘性末端和平末端两类。粘性末端指酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基的单链结构，且片段两端突出的单链具有互补性。突出的单链因部位的不同，又可分为5-与3-粘性末端两种，突出的单链带5磷酸单酯的称5-粘性末端；突出的单链含3-羟基则称3-粘性末端。平末端指酶切后，片段为齐头末端结构。在DNA体外重组时，粘性末端是DNA连接酶的高效底物，有很高的连接效率。 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。实验五 大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化一、实验目的1、了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义；2、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌感受细胞并筛选转化体的方法。二、实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R，M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl（KCl）等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（competence cell）。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状（如抗生素的抗性）。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC18质粒共保温，实现转化。由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。三、实验仪器及试剂（一）仪器和材料恒温摇床、电热恒温培养箱、超净台、电热恒温水浴、分光光度计、台式离心机、离心管、移液器、Eppendorf管、E.coli DH5、pUC18质粒DNA等。（二）实验试剂1、LB液体培养基细菌培养用胰化蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 10g搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/L NaOH（约0.2ml）调节pH值7.4，加入去离子水至总体积为1L，高压蒸汽15磅灭菌20分钟。2、LB琼脂平板培养基在LB培养液中加入1.5的琼脂，高压蒸汽15磅灭菌20分钟。3、氨苄青霉素储液称取50mg氨苄青霉素，溶于1ml水中，通过0.22um滤器除菌，配得氨苄青霉素储液。4、LBA平板培养基：将配好的LB琼脂平板培养基高压灭菌后，冷却至60左右，加入氨苄青霉素，使终浓度为50g/ml，摇匀后铺板。5、0.1mol/L CaCl2：称取1.10g CaCl2（无水、分析纯），溶解在100ml无菌双蒸水中，灭菌处理后，避光储存于4冰箱。四、实验步骤（一）受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右。（二）感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将受体菌在琼脂培养基平板上划线，37培养16小时。（具体操作为用灭菌接种环取大肠杆菌一环，涂在培养基平板表明靠近皿边的位置上，然后用接菌环从这里开始往返在培养基表面划线，注意不可划破表面，线条尽可能靠近，末端可以发育成单个菌落。）2、在平板上挑取一单菌落，菌落直径大小约为12mm，接种于含50mlLB的300ml锥形瓶中，37 300r/min强烈震荡培养，当培养液出现浑浊后，每隔2030分钟测一次OD600，当0.6时，停止培养，此时细胞的浓度达到5107个细胞/ml，细菌为对数生长期或对数生长前期。3、将1ml培养液转移到1.5ml Eppendorf管离心管中，在冰上放置10分钟，然后4000r/min，4离心10分钟。4、弃上淸，倒置离心管流尽剩余液体，每个管中各加入0.2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟。然后4000r/min，4离心5分钟，回收细胞。5、弃上淸，每1ml的原培养液再加入40l冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。6、分装于微量离心管中（每管1ml），放置于冰上，24小时内可直接用于转化实验。（可将细胞在4放置1224小时，感受态细胞可以加入终浓度为10的灭菌甘油，置于70冻存）。（三）感受态细胞的转化1、在40l上述感受态细胞悬液中，加入1l pUC18质粒DNA溶液，其含量不超过50ng，此管为转换实验组。2、将上述各样品轻轻摇匀，冰上放置30分钟后，于42水浴中保温2分钟，热休克，促进细胞吸收DNA复合物，然后迅速置于冰浴中冷却3分钟。3、在上述试管中加入160l LB液体培养基，则总体积约为0.2ml，该溶液称为转化反应原液。混匀，于37水浴温浴15分钟以上，使受菌体恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性，即细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。注意：1）为了获得高感受性细胞，应选用处于对数生长期的细胞OD600不应高于0.6，并且在整个实验过程中需将细胞置于冰上。2）细胞在冷冻后即使获得了感受性，而在80几小时后感受性达到最高值。至少几个月均能维持高水平的感受态。（四）抗生素平板筛选转化体1、将上述培养的转化反应原液摇匀后，进行梯度稀释，方法见下表：试管号 1 2 3 原液 1号 2号加入的样品液（ml） 0.05 0.05 0.05 LB液体培养基（ml） 0.45 0.45 0.45 稀释浓度 101 102 103 稀释倍数 101 102 1032、分别取上述稀释度的各样品培养液200l，铺于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀。3、室温下放置20分钟，待溶液被培养基完全吸收后，倒置平皿，于37恒温培养箱内培养12小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时，停止培养。五、检出转化体和计算转化率统计每个培育皿中的菌落数，在含抗菌素培养液平皿中长出的菌落即为转化体，根据此培育皿中菌落数则可计算出转化体总数和转化频率，计算公式如下：转化体总数菌落数稀释倍数实验六 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳一、实验目的1、 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验原理，掌握其操作规程。2、 掌握电泳法分离蛋白质。二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷，分子大小及形状的差别分离物质。这种介质既具有分子筛效应，又具备静电效应，所以分辨力高于琼脂糖凝胶电泳。聚丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N亚基双丙稀酰胺（Bis）在催化剂N，N，N ，N四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）存在的条件下，交叉连接形成三维的网状结构。凝胶交联形成的小孔的孔径大小主要与以下因素有关：（1）交联度（C），即双丙稀酰胺占丙稀酰胺总计的质量比。孔径随着二者比率的增大而减小，比率接近1:20，孔径达到最小值。一般实验常用比率为1:29。可分离大小相差3的多肽。（2）浓度（T），即灌胶时所用丙稀酰胺和双丙稀酰胺的总的百分浓度，一般根据所需分离的范围选择浓度。515的丙稀酰胺所灌制凝胶的分离范围如下： 丙稀酰胺浓度（） 线性分离范围（KDa）15 124310 16287.5 36945.0 57212 注：双丙稀酰胺:丙稀酰胺1:29选择T和C的经验性公式：C=6.50.3T丙稀酰胺凝胶常规灌制于两块封闭的平板之间，然后进入垂直电泳。主要是因为氧能抑制丙稀酰胺的聚合反应，在密封的双玻璃平板的夹层中灌胶后，仅有顶层的部分凝胶与空气中的氧接触，从而大大减弱了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳按其使用凝胶的孔径和缓冲系统的不同，可分为连续电泳和不连续电泳。不连续电泳因其分辨率高、上样量大而受到广泛应用。不连续电泳的凝胶按孔径大小不同分为浓缩胶与分离胶。浓缩胶（concentrating gel）又称堆积胶（stacking gel），凝胶浓度较小，孔径相对较大。把较稀释的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，使样品在分离胶中得以高分辨率的分离。分离胶（separation gel，resolving gel）又称电泳胶（running gel），通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可分为均一胶和梯度胶。浓缩胶和分离胶常使用相同的缓冲系统，但pH不同。前者用pH6.8的Tris-HCl，后者用pH8.8的Tris-HCl，前者凝胶浓度常用45，后者则根据被分离样品的情况而定。三、实验步骤1、玻璃板洗干净，将玻璃板和硅胶条装好。2、根据实验的要求配置不同浓度的分离胶，同时根据不同的电泳槽所需的凝胶体积，按比例调整各成分的量。溶液成分不同体积聚丙烯酰胺凝胶（12）中各成分的添加量（ml）5 10 15 20 25 30 40 50水1.63.34.96.68.29.913.216.530丙稀酰胺2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mmol/L Tris（pH8.8）1.32.53.85.06.37.51012.510SDS0.050.10.150.200.250.30.40.510%AP0.050.10.150.200.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02注：在小烧杯中混匀所加液体，立即使用，TEMED最后加入。3、用加样器将胶缓慢注入两玻璃板空隙中，不时轻敲玻璃板让气泡上浮，直至距加样孔底1cm处。4、在胶的表面缓慢加100l水，等待胶的聚合。凝胶聚合后，可以看到凝胶和水之间有一层明显的分界线，标志凝胶已聚合，这是由于光线透过透明介质不同密度不同折射率的区域时，光学折射产生的波纹。倒去水，用滤纸吸去残余水分。5、配置浓缩胶。溶液成分不同体积分离胶（5）中各成分的添加量（ml）1 2 3 4 5 6 7 8水0.681.42.12.73.44.15.56.830丙稀酰胺0.170.330.50.670.831.01.31.71.5mmol/L Tris（pH8.8）0.130.250.380.50.630.761.01.2510%AP0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01注：在小烧杯中混匀所加液体，立即用加样器加入两块玻璃板之间。6、立即插入适当的梳齿，注意勿使梳齿下带进气泡，梳顶部应比玻璃板顶部略高些。7、室温下聚合0.5小时，若凝胶明显回缩，再添些丙稀酰胺溶液，梳齿下出现明显的折光线时，标志聚合反应已经完成。将两块玻璃板连同凝胶一起取出，前后翻转，重新装好电泳槽，用记号笔表明加样孔的位置。8、将夹有凝胶的玻璃板放入电泳槽中，检查是否有泄漏。在电泳装置的上缓冲液室和下缓冲液室加入1Tris甘氨酸电泳缓冲液，注意使上缓冲液室中的电泳缓冲液刚好淹没凝胶的加样孔格。9、小心取出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺加样孔格。立即用1Tris甘氨酸电泳缓冲液冲洗孔格。冲洗孔格这一操作不能省略，因为梳子取出后，梳子上吸附的和胶顶部尚未聚合的丙稀酰胺会流入孔格内，再聚合后使孔格底部不整齐，导致以后电泳带型的不整齐。10、用加样器将已与上样缓冲液混好的蛋白质样品等体积（约10l）加入到样品孔中。11、接通电源，正极与下层缓冲液室相连，选择电压为30V（约15mA）电泳10min至溴酚兰染料进入凝胶，然后将电压调至60V（约30mA）电泳24h，至溴酚兰泳出凝胶，电泳过高将引起升温，导致带型弯曲。12、关闭电源，撤去导线。取出玻璃模具，平放于桌上，小心将上面的玻璃板从角上轻轻掀开，去除两侧垫条，切去胶的一角作为标记。13、染色（1）将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器中并以35倍体积的固定液（冰乙酸/甲醇/水（102070）覆盖，在旋转摇床中缓慢摇动至少15min。（2）倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液（0.25g考马斯亮蓝溶解于90ml甲醇/水（11）和10ml冰醋酸中）覆盖凝胶，并缓慢摇动3040min。（3）倾去染色液，用约50ml ddH2O冲洗凝胶。（4）倾去固定液，以脱色液（30%甲醇与10%乙酸混合液）覆盖凝胶，缓慢摇动2h，倾去脱色液，再加入新脱色液同时至获得蓝色条带及干净的背景，凝胶可放在7乙醇或水中保存。实验七 蛋白质免疫印迹分析一、实验目的1、学习蛋白质印迹免疫分析的原理、应用等基本知识。2、掌握蛋白质印迹免疫分析的基本操作和结果分析。二、基本原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到固相支持膜上，然后利用相应抗体进行检测的技术。蛋白质印迹免疫分析的过程包括 蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上； 经封闭后再用待检蛋白质的抗体与之结合； 经洗涤后，再将滤膜与二级试剂（放射性标记或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联抗免疫球蛋白抗体）结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原抗体抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。 目前，Western blot广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。三、实验仪器及试剂（一）仪器转移电泳仪，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀，手套，小尺图1 BioRad蛋白质电泳装置图2 BioRad蛋白质电转移装置（二）试剂1、SDS-PAGE试剂。 2、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml。 3、 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加ddH2O至1000ml。4、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。5、显色液DAB（