猪基质金属蛋白酶酶联免疫分析(MMP-9ELISA).doc

猪基质金属蛋白酶酶联免疫分析(MMP-9 ELISA）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究研究使用产品编号：E0553p预期应用ELISA法定量测定猪血清、血浆、唾液、细胞培养物上清或其它相关液体中MMP-9含量。概述 MMP-9基因位于染色体20q11.113.1，2627kbp，具有13个外显子和9个内含子。哺乳类动物MMP-9mRNA的同源性约为80%。MMP-9的启动子区内含有活化蛋白(AP)-1、AP-2和刺激蛋白(SP)-1因子结合位点，猪的MMP-9启动子区还有核因子(NF)B、ETS结合位点和转化生长因子(TGF)-抑制元件MMPs主要由3个独特的、保守的结构域构成，包括前肽区(氨基末端区)、催化区和羧基末端区(类血红素结合蛋白酶区)。MMP-9是明胶酶中的一种，除了有MMPs的原型结构外，MMP-9的催化区还包括3个重复的型纤维连接蛋白结构域，这个结构域与明胶或弹性蛋白有高度的亲和力。MMP-9包含一个V型的胶原蛋白结构域,这个结构域有高度的糖基化作用，,它影响底物的特异性以及有抗衰变的作用。MMP-9有许多作用底物，如、型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也是MMP-9作用的底物。 MMP-9是以酶原的形式从胞内分泌到胞外，在体外，MMP-9通过有机汞制剂反应才有活性，在体内则可经一系列蛋白酶级联而激活。这个胶原蛋白结构域可被MMP-3、MMP-2或者次氯酸裂解，而不是纤维蛋白溶酶、凝血酶或者MMP-1。MMP-3可能是MMP-9最有效的激活剂。MMP-9主要的循环抑制剂是2巨球蛋白，活化的MMP-9被2巨球蛋白捕获并通过清除受体被清除出循环系统。金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs家族的组织抑制剂，广泛分布于组织和体液中，共价结合MMPs而抑制其活性。TIMP-1作为MMP-9的抑制剂，与MMP-9的酶原或活化后酶的催化区的羧基末端特异性结合，形成复合物，,从而特异性抑制MMP-9的活性。另外，血小板反应蛋白和蛋白酶组织抑制因子2(TFPI-2)也能抑制MMP-9的活性。 MMP-9的生理作用广泛。MMP能分解呼吸道和肺内的结构复合物如ECM和基底膜,因此能参与呼吸道和肺的重建，它还能调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，它能降解1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性,能加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP-13的溶胶原活动，并且MMP-9还能从白细胞介素8(CXCL8/CL8)上分解一个62氨基酸肽,使其向中性粒细胞的趋化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒细胞的趋化因子。此外，MMP-9结合CD44可释放储存的TGF-1，另外，MMP-9可通过释放血管内皮生长因子(VEGF)以参与血管生成。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MMP-9水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗大鼠MMP-9抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-9呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成 1. 酶联板：一块（96孔） 2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为20000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成20000 pg/mL，10000 pg/mL ，5000 pg/mL，2500pg/mL，1250pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15分钟内配制。3. 样品稀释液：120ml/瓶。4. 抗体稀释液A：110ml/瓶。5. 抗体稀释液B：110ml/瓶。6. 检测溶液A：1120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液A1：100稀释。7. 检测溶液B：1120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液B1：100稀释。8. 底物溶液：110ml/瓶。 9. 浓洗涤液：130ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：110ml/瓶（2N H2SO4）。 标本的采集及保存 1细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20，且应避免反复冻融。2血清：标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。3血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8 C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37，120分钟。2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，37,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，37，60分钟，洗板5次，甩干。5. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光显色30分钟。6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 注：1 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 2为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的猪MMP-9，且与其它相关蛋白无交叉反应。计算 以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项1 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。4 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请