紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径.doc

www.CRTER.org付元，等. 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径*付 元1，刘秀琴2，程 娜1，张守青1，常 红1，张秋业1，陈秀霞1，高兴娟3 (1青岛大学医学院附属医院儿内科，山东省青岛市 266003；2青岛市市立医院儿内科，山东省青岛市 266003；3烟台市毓璜顶医院儿内科，山东省烟台市 264000)文章亮点：1 文章的特点在于应用荧光定量PCR和流式细胞技术检查了TLR3和TLR4在外周血单个核细胞的表达量及相关性，分析了过敏性紫癜患儿有肾脏损伤和无肾脏损伤的免疫紊乱情况。2 结果提示Toll样受体4活化可能是导致过敏性紫癜免疫功能紊乱的始动因素之一，Toll样受体4的过度活化与过敏性紫癜的肾脏损伤有关。关键词：器官移植；器官移植基础实验；过敏性紫癜；紫癜性肾炎；单个核细胞；Toll样受体3；Toll样受体4；髓样细胞分化因子88；髓样分化蛋白2；白细胞介素类；省级基金主题词：紫癜，过敏性；Toll样受体3；Toll样受体4；白细胞介素类基金资助：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011SW006)*摘要背景：目前关于Toll样受体3和Toll样受体4介导的信号转导通路在紫癜性肾炎的发病机制中的作用尚不清楚。目的：分析Toll样受体3和Toll样受体4在过敏性紫癜和紫癜性肾炎发病机制中的作用。方法：选取过敏性紫癜患儿64例，分为过敏性紫癜无肾损害组36例及过敏性紫癜性肾炎组28例，另选健康儿童30例作为正常对照组。实时荧光定量PCR检测外周血单核细胞Toll样受体3、Toll样受体4、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12 mRNA的基因相对表达量；应用流式细胞术检测外周血单核细胞Toll样受体3、Toll样受体4蛋白表达率。结果与结论：过敏性紫癜患儿Toll样受体4 mRNA及蛋白表达显著高于正常对照组(P 0.05)。紫癜性肾炎组Toll样受体4 mRNA及蛋白表达均显著高于紫癜无肾损害组(P 0.05)。过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达均显著高于正常对照组(P 0.05)，白细胞介素12 mRNA的表达显著低于正常对照组(P 0.05)；紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达显著高于紫癜无肾损害组(P 0.05)，紫癜性肾炎组白细胞介素12 mRNA的表达显著低于紫癜无肾损害组(P 0.05)。过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与蛋白表达呈正相关(r=0.60，P 0.01)；过敏性紫癜患儿Toll样受体4 mRNA与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6表达均呈正相关(P 0.01)，与白细胞介素12 mRNA表达呈负相关(r=-0.66，P 0.01)。提示Toll样受体4可能通过髓样细胞分化因子88依赖信号转导途径介导过敏性紫癜的免疫发病机制，Toll样受体4的过度活化可能与过敏性紫癜的肾损伤有关。Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 signal transduction pathways in the peripheral blood mononuclear cells of purpura nephritis patients Fu Yuan1, Liu Xiu-qin2, Cheng Na1, Zhang Shou-qing1, Chang Hong1, Zhang Qiu-ye1, Chen Xiu-xia1, Gao Xing-juan3 (1Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 2Departemt of Pediatrics, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 3Department of Pediatrics, Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China)付元，女，1987年生，山东省曲阜市人，青岛大学医学院在读硕士，主要从事肾脏疾病与免疫疾病的研究。 fy_通讯作者：常红，副主任医师，硕士生导师，青岛大学医学院附属医院儿内科，山东省青岛市266003 中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2013)53-09182-07修回日期：2013-10-17(201308011/WW)Fu Yuan, Studying for masters degree, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, Chinafy_Corresponding author: Chang Hong, Associate chief physician, Masters supervisor, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, CAccepted: 2013-10-17AbstractBACKGROUND: Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 may be play a significant role in the pathogenesy of many diseases about the renal, but, at present, the influence of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 signal transduction pathway in children with Henoch-Schnlein purpura nephritis has been unknown.OBJECTIVE: To investigate the mechanism of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 in Henoch-Schnlein purpura and Henoch-Schnlein purpura nephritis.METHODS: Totally 64 children with a clinical diagnosis of Henoch-Schnlein purpura were enrolled in the study and divided into two groups, 36 children with non-Henoch-Schnlein purpura nephritis, and 28 children with 9183ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHHenoch-Schnlein purpura nephritis. Another 30 healthy age-matched children served as controls. The relative expression levels of Toll-like receptor 3, Toll-like receptor 4, myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-12 mRNA in peripheral blood mononuclear cells were detected by real-time fluorescent PCR. Protein levels of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 were detected by flow cytometric analysis.RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the relative expression levels of Toll-like receptor 4 mRNA and protein were remarkably increased in children with Henoch-Schnlein purpura (P 0.05); compared with the children with non-Henoch-Schnlein purpura nephritis, the relative expression levels of Toll-like receptor 4 mRNA and protein were remarkably increased in children with Henoch-Schnlein purpura nephritis (P 0.05). (2) Compared with the control group, mRNA expression levels of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, and interleukin-6 were remarkably increased in children with Henoch-Schnlein purpura (P 0.05), while interleukin 12 mRNA expression level was remarkably decreased (P 0.05). Compared with the children with non-Henoch-Schnlein purpura nephritis, the mRNA expression levels of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, and interleukin-6 were remarkably increased in children with Henoch-Schnlein purpura nephritis (P 0.05), while the mRNA expression of interleukin 12 was remarkably decreased (P 0.05). (3) The mRNA expression of Toll-like receptor 4 showed a positive correlation with expressions of Toll-like receptor 4 protein (r=0.60, P 0.01), myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, and interleukin-6 mRNA (P 0.01), but negative with interleukin-12 mRNA (r=-0.66, P 0.01). These findings indicate that Toll-like receptor 4 activation may be involved in the pathogenesis of Henoch-Schnlein purpura and the excessive activation of Toll-like receptor 4 may be associated with the damage of kidney in the Henoch-Schnlein purpura. Subject headings: purpura, Schoenlein-Henoch; Toll-like receptor 3; Toll-like receptor 4; interleukinsFunding: the Research Award Fund for Outstanding Young Scientists in Shandong Province, No. BS2011SW006*Fu Y, Liu XQ, Cheng N, Zhang SQ, Chang H, Zhang QY, Chen XX, Gao XJ. Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 signal transduction pathways in the peripheral blood mononuclear cells of purpura nephritis patients. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9182-9188.9187ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction过敏性紫癜是儿童时期常见的系统性血管炎性疾病，合并肾脏受累时称为紫癜性肾炎，肾脏受累的严重程度往往直接影响到本病的病程和预后1。迄今其病因及发病机制尚未完全阐明2-3。目前认为，感染为主要的发病诱因，发病机制主要为免疫功能紊乱。Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)是近年来发现的一类模式识别受体，通过识别病原相关分子，激活天然免疫，最终产生一系列炎症细胞因子释放和启动适应性免疫应答4。研究显示TLRs信号通路介导多种感染性和非感染性肾脏疾病5，如尿路感染、脓毒症引起肾衰竭、病毒性相关性肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等。而有关TLRs与紫癜性肾炎发病机制关系的研究尚未见报道。文章通过检测Toll样受体3、Toll样受体4、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12 在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞的表达，探讨Toll样受体3和Toll样受体4信号转导途径在紫癜性肾炎免疫发病机制中的可能作用。1 对象和方法 Subjects and methods设计：病例-对照研究。时间及地点：于2011年10月至2012年11月在青岛大学医学院附属医院儿研所和中心实验室完成。对象：选取2011年11月至2012年11月在本院收治的过敏性紫癜急性发作期患儿64例作为研究对象，其中男38例，女26例；年龄在3-14岁之间，平均年龄为6.9岁。根据2000年中华医学会儿科学分会肾脏病学组紫癜性肾炎的诊治循证指南6，分为过敏性紫癜无肾损害组及过敏性紫癜有肾损害组。其中紫癜性肾炎组28例，紫癜无肾损害组36例。另选取本院儿保科健康体检儿童30例作为正常对照组，其中男17名，女13名，年龄4-12岁。平均年龄为6.4岁。所有检查均获得受试者家属知情同意后实施，并报医院医学伦理会讨论通过。诊断标准：根据2006年EULAR/PReS过敏性紫癜诊断标准进行诊断7。纳入标准：均符合2006年EULAR/PReS过敏性紫癜诊断标准。年龄14岁。首次发病。近4周内未使用任何糖皮质激素、免疫抑制剂或肝素等药物。排除标准：反复发作的过敏性紫癜、血小板减少性紫癜、白血病、血友病。Toll样受体3和Toll样受体4信号转导途径在紫癜性肾炎发病机制中的作用实验所用材料：试剂淋巴细胞分离液 SYBGreen试剂盒 ABI7000型荧光定量PCR仪 引物 Solarbio公司大连宝生物有限公司Applied Biosystems公司由上海生工生物工程股份有限公司合成来源方法：分离外周血单个核细胞：无菌采取肝素钠抗凝静脉血3 mL，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。cDNA的合成：外周血单个核细胞总RNA的提取：取已分离的外周血单个核细胞，加入RNAisoPlus裂解后，先后加入氯仿、异丙醇、体积分数75%的乙醇低温离心后获得总RNA，应用核酸定量分析仪测量总RNA的浓度和纯度，所有标本的A260/A280比值是在1.8-2.0之间。反转录-聚合酶链反应：在50 L的反转录反应体系中，以2.5 g mRNA为模板逆转cDNA。取1 L的cDNA为模板，进行PCR扩增，目的基因mRNA序列相关引物的参数见表1。表1 RT-PCR荧光实时定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of real-time fluorescent PCR基因序列复性温度()长度(bp)Toll样受体3Toll样受体4髓样分化蛋白2髓样细胞分化因子88白细胞介素1白细胞介素6白细胞介素12GAPDH上游引物：5-GTC CAA CGG CTT TGA CGA GAT-3 下游引物：5-CTG GCC CGA AAA CCT TCT TCT-3上游引物：5-TGT CCT CCC ACT CCA GGT AAG T-3 下游引物：5-GAT TGC TCA GAC CTG GCA GTT-3上游引物：5-ATT CCA AGG AGA GAT TTA AAG CAA TT-3 下游引物：5-CAG ATC CTC GGC AAA TAA CTT CTT-3 上游引物：5-GCA CAT GGG CAC ATA CAG AC-3 下游引物：5-TGG GTC CTT TCC AGA GTT TG-3上游引物：5-CCA CGG CCA CAT TTG GTT-3 下游引物：5-AGG GAA GCG GTT GCT CAT C-3上游引物：5-TCG GTC CAG TTG CCT TCT CC-3 下游引物：5-TCT GAA GAG GTG AGT GGC TGTC-3上游引物：5-TGC AAA GCT TCT GAT GGA TCC T-3 下游引物：5-CTG CCC GAA TTC TGA AAG CA-3 上游引物：5-TCA TGG GTG TGA ACC ATG AGA A-3下游引物：5-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3596056585861586018814310023971127194146反转录-聚合酶链反应产物鉴定：取Toll样受体3、Toll样受体4、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12及GAPDH扩增产物3 L在2%琼脂糖凝胶中，120 V电泳30 min，经紫外线图像成像系统(DU640型)观察，并用凝胶成像仪进行拍摄；以验证引物的特异性及获得引物的最适退火温度。实时荧光定量PCR(real-timePCR)：采用SYBGreen试剂盒，使用ABI7000型荧光定量PCR仪检测，应用Rotor gene 6软件进行荧光信号的收集和结果分析。荧光定量PCR的数据采用2-ct法进行相对定量，具体计算方法参考文献8。流式细胞术：采集肝素抗凝的新鲜的外周静脉血 2 mL，取100 L加入10 L抗体组合为CD14-FITC/ Toll样受体3(Toll样受体4)-PE的流式试管中。对照组取 100 L标本加入到10 L抗体组合为CD14-FITC/ IgG2a-PE的流式试管中。混匀，室温避光孵育15 min。加入溶血素3 mL，混匀后静置15 min。2 000 r/min离心5 min，倒去上清，加入磷酸盐缓冲液(PBS)，2 000 r/min离心5 min，倒去上清液，加入500 L的PBS，放入Cytomics FC500型流式细胞检测，测定10 000个外周血单核细胞中抗人CDl4-FITC抗体和抗人Toll样受体3/Toll样受体4-PE抗体染色双阳性细胞百分率。流式细胞术的数据经CXP分析软件获取分析。主要观察指标：Toll样受体3和Toll样受体4蛋白在外周血单个核细胞膜表面的表达。Toll样受体3和Toll样受体4信号转导通路的相关分子在外周血单个核细胞细胞膜表面的表达。Toll样受体3和Toll样受体4活化后基因表达的量。统计学分析：所有数据处理均采用SPSS 17.0软件包进行分析，检测结果以s表示；两组独立样本经方差齐性检验后，方差齐性，采用t 检验；多组样本均数比较采用单因素方差分析；相关分析采用Pearson分析，P 0.05)；Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高于正常对照组 (P 0.05 0.05 0.05 0.05注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高于正常对照组。注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4蛋白表达显著高于正常对照组(P 0.05)。图1 过敏性紫癜组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白表达 Figure 1 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the Henoch-Schnlein purpura group紫癜性肾炎组Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高于紫癜无肾损害组，差异有显著性意义 (P 0.05)，结果见表4，图2-4。2.4 各组儿童外周血单核细胞髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12mRNA的表达变化 过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达显著高于正常对照组，差异均有显著性意义(P 0.05)，白细胞介素12 mRNA的表达显著低于正常对照组，差异有显著性意义(P 0.05)。见表5。组别Toll样受体4 mRNAToll样受体4蛋白紫癜性肾炎组紫癜无肾损害组正常对照组F 1.940.65ab1.470.751.040.4914.05 0.410.22ab0.2523.58与紫癜无肾损害组比较，aP 0.05；与正常对照组比较，bP 0.05。注：紫癜性肾炎组Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高于紫癜无肾损害组。表4 紫癜性肾炎、紫癜无肾损害组和正常对照组外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA和蛋白的表达变化Table 4 Expression of Toll-like receptor 4 mRNA and protein in peripheral blood mononuclear cells of non-Henoch-Schnlein purpura nephritis patients, Henoch-Schnlein purpura nephritis patients and healthy controls (s)注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4蛋白表达显著高于正常对照组(P 0.05)。图2 正常对照组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白表达 Figure 2 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the control group注：紫癜无肾损害组Toll样受体4蛋白表达显著低于紫癜性肾炎组。图3 紫癜无肾损害组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白表达 Figure 3 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the non-Henoch-Schnlein purpura nephritis group注：紫癜性肾炎组Toll样受体4蛋白表达显著高于紫癜无肾损害组。图4 紫癜性肾炎组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白表达 Figure 4 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the Henoch-Schnlein purpura nephritis group表5 过敏性紫癜组与正常对照组外周血单核细胞髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12 mRNA的表达Table 5 mRNA expressions of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-12 in the Henoch-Schnlein purpura and control groups (s)指标过敏性紫癜组正常对照组tP髓样分化蛋白2髓样细胞分化因子88白细胞介素1白细胞介素6白细胞介素121.150.371.210.391.520.451.050.320.430.170.830.300.870.220.790.380.680.330.690.204.095.396.294.215.31 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05注：过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达显著高于正常对照组，白细胞介素12 mRNA的表达显著低于正常对照组。紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达显著高于紫癜无肾损害组，差异均有显著性意义(P 0.05)，紫癜性肾炎组白细胞介素12 mRNA的表达显著低于紫癜无肾损害组，差异有显著性意义(P 0.05)，见表6。2.5 过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与Toll样受体4蛋白表达相关性 过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与Toll样受体4蛋白表达呈正相关(r=0.60，P 0.01)，见图5。2.6 过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与其他相关分子表达相关性 过敏性紫癜患儿Toll样受体4mRNA与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6表达均呈正相关(P 0.05)，与白细胞介素12 mRNA表达呈负相关(r=-0.66，P 0.01)，见表7。表6 紫癜性肾炎、紫癜无肾损害组和正常对照组外周血单核细胞髓样细胞分化因子88、髓样分化蛋白2、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12 mRNA的表达Table 6 mRNA expressions of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-12 in the non-Henoch-Schnlein purpura nephritis, Henoch-Schnlein purpura nephritis and control groups (s)指标过敏性紫癜组紫癜无肾损害组正常组tP髓样分化蛋白2髓样细胞分化因子88白细胞介素1白细胞介素6白细胞介素121.260.37ab1.350.45ab1.640.30ab1.130.27ab0.330.12ab1.060.361.100.301.320.540.920.360.590.120.830.300.870.220.790.380.680.330.690.2011.4115.2529.2314.3466.08 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05与紫癜无肾损害组比较，aP 0.05；与正常对照组比较，bP 0.05。注：紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达显著高于紫癜无肾损害组，紫癜性肾炎组白细胞介素12 mRNA的表达显著低于紫癜无肾损害组。1.00.20Toll样受体蛋白0 1 2 3 4Toll样受体4 mRNA注：过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与Toll样受体4蛋白表达呈正相关(r=0.60，P 0.01)。图5 过敏性紫癜组外周血单核细胞Toll样受体4蛋白与Toll样受体4 mRNA的相关图Figure 5 Correlation between Toll-like receptor 4 protein and mRNA expression in the Henoch-Schnlein purpura group表7 过敏性紫癜组Toll样受体4与各因子的表达相关性Table 7 Correlation expression of Toll-like receptor 4 and other receptors in the Henoch-Schnlein purpura group指标 r P髓样分化蛋白2髓样细胞分化因子88 白细胞介素1 白细胞介素6 白细胞介素12 0.66 0.67 0.66 0.64 -0.66 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4 mRNA与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6表达均呈正相关，与白细胞介素12 mRNA表达呈负相关。3 讨论 Discussion过敏性紫癜是儿童时期较常见的一种小血管炎，发病率高，容易反复，根据不同的临床症状及体征，可将过敏性紫癜分为皮肤型、腹型、肾型、关节型、混合型等，据文献报道20%-80%的过敏性紫癜患儿会有肾损害发生9-10。其病因及发病机制尚未完全明确，可能涉及体液免疫和细胞免疫紊乱，同时有细胞因子和炎症介质的参与。Toll样受体是天然免疫模式识别受体之一，与微生物的病原相关分子模式识别激活固有免疫系统；研究发现Toll样受体分布十分广泛，不同的TLR在不同组织及细胞表达有所不同，主要表达于单核-巨噬细胞、树突状细胞等11。TLRs识别配体包括外源性及内源性两种，Toll样受体3主要识别病毒感染细胞后产生的dsRNA12，Toll样受体4主要识别脂多糖，髓样分化蛋白2蛋白与Toll样受体4胞外区结合而定位于细胞表面13，并促进细胞对脂多糖的反应。TLR信号通路包括髓样细胞分化蛋白88依赖性或髓样细胞分化因子88非依赖性途径激活核转录因子B、IRF3诱导细胞因子及趋化因子基因转录。Toll样受体3主要参与非髓样细胞分化因子88依赖的转导14，Toll样受体4既参与髓样细胞分化因子88依赖的转导又参与非髓样细胞分化因子88依赖转导途径15。目前研究较为明确的为髓样细胞分化因子88依赖途径。TLR通过两条信号途径转导细胞信号后，一方面刺激天然免疫细胞分泌大量的细胞因子、趋化因子诱导炎症反应，另一方面诱导树突状细胞活化及成熟，促进协同刺激分子和趋化因子的表达与释放，从而诱导T细胞活化、增殖和发育。因此TLRs是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁16。近年来国内外研究显示，TLRs信号通路在自身免疫性疾病、超敏反应、炎症反应、细胞凋亡及移植排斥反应中发挥重要的作用。研究发现TLRs在肾小管上皮细胞、足细胞、肾小球系膜细胞等肾脏固有细胞及间质树突状细胞中表达17，TLRs信号通路介导多种感染性和非感染性肾脏疾病，如尿路感染、脓毒症引起肾衰竭、肾脏再灌注损伤、病毒性相关性肾炎、IgA肾病、新月体性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、微小病变性肾病、肾纤维化等18-23。但TLRs与过敏性紫癜、紫癜性肾炎的相关报道较少。本组结果显示，过敏性紫癜患儿Toll样受体3 mRNA及蛋白表达与正常对照组比较，差异无显著性；过敏性紫癜患儿Toll样受体4mRNA及蛋白的表达均高于正常对照组，过敏性紫癜有肾脏损害组Toll样受体4mRNA及蛋白的表达量均高于过敏性紫癜无肾脏损害组；提示Toll样受体4活化可能是导致过敏性紫癜免疫功能紊乱的始动因素之一，Toll样受体4的过度活化与过敏性紫癜的肾脏损伤有关。白细胞介素1主要是由单核细胞和树突状细胞合成，当作用于肾小球系膜细胞后还可刺激系膜细胞合成白细胞介素1。该细胞因子可刺激肾小球系膜细胞合成降解胶原和基底膜的中性蛋白酶从而破坏肾小球24；还可刺激系膜细胞分泌单核细胞趋化因子，趋化单核巨噬细胞的浸润，促进局部肾脏炎症反应。同时白细胞介素1可促进内皮细胞合成纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)，使纤溶酶原活性下降，促进凝血，促使新月体的形成，加重肾脏损害25。白细胞介素6也可由单核巨噬细胞和系膜细胞等合成，在其他细胞因子存在时可直接刺激肾小球系膜组织增生，导致肾小球纤维化，白细胞介素6亦可促使B细胞增殖并产生大量IgE、IgA，沉积于肾小球系膜区引起肾炎26。白细胞介素12是目前已知特异性最强的能独立诱导Th0向Th1细胞的分化与增殖的细胞因子27，可以诱导Th1细胞的形成，避免Th2的活化，在调节Th1/Th2的平衡起重要作用。本组结果显示，过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达均显著高于正常对照组，白细胞介素12 mRNA的表达显著低于正常对照组，过敏性紫癜患儿Toll样受体4 mRNA与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6表达均呈正相关，与白细胞介素12 mRNA表达呈负相关。过敏性紫癜有肾损害组白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA较过敏性紫癜无肾损害组过表达而白细胞介素12 mRNA低表达，提示Toll样受体4经髓样细胞分化因子88依赖途径的信号转导通路异常活化，导致细胞因子失调，白细胞介素1、白细胞介素6 过度产生，白细胞介素12产生不足致Th0向Th1分化减弱，Th2优势活化，引起Th1/Th2失衡，参与过敏性紫癜发病，加重过敏性紫癜的肾损伤。其具体机制尚需进一步的实验研究。综上，过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体4蛋白及Toll样受体4 mRNA、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA表达明显升高，有肾损害组上述分子表达水平明显高于无肾损害组；过敏性紫癜患儿外周血单核细胞白细胞介素12 mRNA表达明显降低，过敏性紫癜有肾损害组明显低于无肾损害组。Toll样受体4可能通过髓样细胞分化因子88依赖信号转导途径介导过敏性紫癜及紫癜性肾炎的免疫发病机制。作者贡献：实验设计为常红，实验实施为付元、程娜、张守青、陈秀霞、高兴娟，实验评估为常红、张秋业，资料收集为付元。付元、常红成文、审校并对文章负责。文章作者均经过系统培训，未使用盲法评估。利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接地经济或利益的赞助。伦理要求：参与实验的患儿监护人自愿参加，对治疗过程完全知情同意。学术术语：Toll样受体-是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。Toll样受体是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，Toll样受体可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。4 参考文献 References1 吴玉斌.过敏性紫癜性肾炎的治疗进展J.中国实用儿科学杂志，2006,21(6):411-413.2 Hamdan JM, Barqawi MA. 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