第3章 蛋白质.doc

第3章 蛋 白 质蛋白质的生物学意义1. 生物体的组成成分2. 酶3. 运输4. 运动5. 抗体6. 干扰素7. 遗传信息的控制8. 细胞膜的通透性9. 高等动物的记忆、识别机构一、蛋白质的化学组成*1. 蛋白质的含氮量氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 6.252. 蛋白质的大小与分子量蛋白质水解的最终产物都是氨基酸。构成蛋白质的氨基酸共20种，称为基本氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的基本单位。（一）依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为：简单蛋白和结合蛋白二、蛋白质的分类1、简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由a-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白(albumin and globulin )：广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：可溶于水或稀酸，碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：溶解度最低，能抗酶水解。存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。2、结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清a-，b-脂蛋白等。核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。(二) 依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质globular protein ：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质fibrous protein ：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。（三）根据蛋白质来源分类 根据蛋白质来源的不同，蛋白质可分为动物性蛋白质、植物性蛋白质和单细胞蛋白质三类。 动物性蛋白质：主要来源于肉类、乳类和蛋类。 肉类蛋白质：约含有70%的结构蛋白和30%的水溶性蛋白质。水溶性蛋白质又可分为肌浆蛋白和肌清蛋白两种。 乳类蛋白质：乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白和脂肪球膜蛋白质。 蛋类蛋白质：蛋类蛋白质包括蛋清、蛋黄蛋白质两类。 植物性蛋白质：主要是来源于蔬菜、谷物和油料种子中的蛋白质。 蔬菜蛋白， 谷类蛋白, 油料种子蛋白。单细胞蛋白质：单细胞蛋白质来源于微生物。在酵母菌中可达40%60%，细菌中甚至可达80%以上。单细胞蛋白质特点是核蛋白含量高，目前主要用于饲料生产。 3.2 氨基酸与肽一、氨基酸氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种基本氨基酸（20 standard amino acids)组成。1、氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到碳原子（C），同时结合到（C）上的是H原子和各种侧链（R）；脯氨酸（Pro）具有二级氨基（-亚氨基酸）（一）氨基酸的结构与分类1.20种氨基酸2、氨基酸的分类根据侧链R的性质不同，可将氨基酸分为四类：非极性或疏水性氨基酸、极性不带电荷氨基酸、在pH7.0时R带负电荷氨基酸和在pH7.0时R带正电荷氨基酸。 非极性或疏水性氨基酸和极性不带电荷氨基酸是中性氨基酸，在pH7.0时R带负电荷氨基酸为酸性氨基酸，在pH7.0时R带正电荷氨基酸为碱性氨基酸。 非极性或疏水性氨基酸 含有非极性的侧链，呈中性，具有不同程度的疏水性。主要包括脂肪烃侧链的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸以及脯氨酸；芳香环侧链的苯丙氨酸和色氨酸；含硫氨基酸的甲硫氨酸或称蛋氨酸。 极性不带电荷氨基酸 侧链带有羟基、巯基或酰胺基等极性基团，因此，比极性基团易溶于水，但在水溶液中不电离。主要包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺和半胱氨酸。甘氨酸虽然不带有R基团，但由于其带电荷的氨基和羧基占据了整个分子的大部分，具有明显的极性，所以也可归入这一类。 R侧链带负电荷的氨基酸 这类氨基酸在pH7.0时带有净的负电荷，在侧链中含有羧基，易解离出H+ 而具有酸性。包括天冬氨酸和谷氨酸两种氨基酸。 R侧链带正电荷的氨基酸 这类氨基酸的R侧链在pH7.0时带有正电荷，易接受H+ 而具有碱性。包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。（二）氨基酸的性质1. 氨基酸的物理性质除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性a-碳原子，因此都具有旋光性。（4）氨基酸的旋光性（5）氨基酸的光吸收在近紫外区(280nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。（1） 氨基酸的离解性质由于氨基酸既含有酸性的羧基（-COOH），又含有碱性的氨基（-NH2），-NH3+ 可以释放H+，而-COO- 可以接受H+，既可以 H3N+CHCOO- 的形式存在。因此，氨基酸是两性电解质。 R 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。2.氨基酸的化学性质碱性溶液（pHpI）氨基酸的等电点(pI)当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子所带正、负电荷数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 （2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法定量 氨基酸的二羟甲基衍生物（3）与亚硝酸的反应氨基酸与亚硝酸发生重氮化反应，生成羟酸，并放出氮气。 反应产生的氮气一半来自氨基酸，另一半来自亚硝酸。在标准条件下，测定反应生成的氮气量可计算氨基酸量。（4）茚三酮反应 所有氨基酸及具有游离-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，常用于氨基酸的定性或定量分析。定量释放的CO2可用测压法测量（5）桑格反应（2,4-二硝基氟苯(DNFB) 反应）与DNFB生成黄色 DNP-氨基酸反应特点A.为- NH2的反应。B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)。C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸。应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。（6）艾德曼（Edman)反应Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。二、 肽（一）肽的结构与命名肽氨基酸通过若干个肽键连接形成的链状结构化合物。二肽由两个氨基酸组成的肽。寡肽由少于十个氨基酸组成的肽。多肽十个以上氨基酸组成的肽。（二）多肽的性质 多肽是由氨基酸以肽键连接而成，因此，多肽可以发生氨基酸的一切反应。如两性解离。但解离情况较为复杂。1. 多肽的水解完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.（1）酸水解常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。（2）碱水解一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。（3）酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶（三） 天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。3.3 蛋白质的结构天然蛋白质的结构主要包括以肽链线形结构为基础的一级结构，以及由肽链卷曲、折叠和盘绕而形成的空间结构蛋白质的二级、三级和四级结构。在二级结构和三级结构间还可分为超二级结构和结构域。一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。维系蛋白质一级结构的主要化学键是肽键。除此之外，还有二硫键（二硫桥）。(1)，测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2)，多肽链的拆分。(3)，二硫键的断裂(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。(8)确定肽段在多肽链中的次序。 (9)确定原多肽链中二硫键的位置二、 蛋白质的空间结构多肽链折叠、盘曲，形成特有而稳定的三维空间结构。具有空间结构的蛋白质才有生物功能。蛋白质构象十分复杂，可分为二级结构、三级结构和四级结构。具有生物功能的完整蛋白质必定具有三级甚至四级结构。蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间盘曲、折叠所形成的构象。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。它不涉及侧链基团的空间排布。二级结构是由肽键的特殊结构决定的。（一）蛋白质的二级结构肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。使C-N键具有部分双键的性质。1、-螺旋-螺旋是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。它是多肽链主链围绕中心轴有规律的向左或向右盘绕而形成的一种螺旋状结构。 螺旋每上升一周需要3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm，每个残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm。-螺旋中的每一个氨基酸残基的侧链基团伸向螺旋的外侧，相邻螺旋之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与螺旋中心轴平行。氢键是由肽键上的-N-H的氢和它后面（N-端）第四个残基上的-CO的氧之间形成的。a-螺旋要点左手和右手螺旋天然蛋白质中存在的-螺旋主要是右手螺旋，既螺旋的走向为顺时针方向。2、b-折叠-折叠也是蛋白质中常见的二级结构，也叫-折叠片或-片层结构。它是两条或多条充分伸展成锯齿状折叠构象的肽链侧向聚集，按肽键的长轴方向平行并列，相邻肽链上的-NH和-CO之间形成有规则的氢键，形成折纸状结构。在b-折叠中，a-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；b-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。b-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。在b-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构，又叫-型回折、-弯曲或发夹结构。是在球状蛋白质分子中发现的另一种二级结构。 -转角多数处在球状蛋白质分子的表面，约占球蛋白全部残基的25%左右，含量十分丰富。3、b-转角4、自由肽段自由肽段蛋白质结构中无规则的肽段，多与蛋白质的功能有关。没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。蛋白质二级结构：-螺旋、-折叠、-转角和自由肽段。（二）蛋白质的超二级结构和结构域在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构聚集体。几种类型的超二级结构： ；超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域1、超二级结构（Rossmann，1973）（三）蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构（四）蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是由两条或多条具有三级结构的多肽链按一定的空间排列方式，通过非共价键缔合在一起形成的蛋白质大分子，通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每一个三级结构单位称为一个亚基（或亚单位，subunit）。它一般由一条肽链构成，无生理活性；连接亚基的非共价键主要为：疏水键、氢键和离子键。四级结构分为均一的（含有相同的亚基）和不均一的（含有不同的亚基）两类。维持亚基之间的化学键主要是疏水力。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；(Quaternary Structure)蛋白质分子中的共价键与次级键一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键1、共价键蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。2、非共价键 而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。1),静电作用 静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。离子键和其它静电作用离子键 生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。偶极-偶极相互作用 2)，氢键 3)，范德华力 4),疏水作用 三、 蛋白质分子结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的关系 关键是看这种改变是否引起了构象的改变。 例1 镰刀形贫血病 (分子病)说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性。（二）蛋白质空间结构与功能的关系 1、蛋白质的变性 一些物理因素（如加热、加压、射线等）和化学因素（如强酸、强碱和有机溶剂等）会破坏蛋白质的空间结构，导致蛋白质生物活性的丧失，同时引起某些物理化学性质的变化，如溶解度降低、发生沉淀等，这类现象叫蛋白质的变性。 变性蛋白质和天然蛋白质在一级结构上相同，只是空间结构发生改变，因而生物活性随之丧失。 在有些情况下，变性作用是可逆的，只要除去变性因素，蛋白质的空间结构还可逐渐恢复，重新恢复其生物活性。变性蛋白质分子恢复其天然形式，称为复性。 蛋白质空间结构的改变会引起功能的改变蛋白质的热变性是因为在较高的温度下，保持蛋白质空间结构的次级键断裂，破坏了肽键特定的空间排列，原来在分子内部的一些非极性疏水侧链暴露到分子表面，因而降低了蛋白质分子的溶解度，促进蛋白质分子间相互结合而凝聚，继而形成不可逆的凝胶而凝固沉淀。 蛋白质热变性的机理：变性蛋白质的特性 溶解度显著减小。不溶于水，在中性溶液中可沉淀或凝固，但溶于酸碱溶液。结晶及生物学活性皆消失。黏度和旋光性负值及分子的不对称性增加，等电点提高。反应基团如SH-基、-S-S-基等数目增加。易被酶氧化。蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固天然蛋白质变性后，变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠结在一起的现象。凝固作用分两个阶段： 第一阶段：变性。 第二阶段：失去规律的肽链聚集缠结在一起而凝固或结絮。 例：鸡蛋加热。热杀菌。思考题：思考：如何辩证的看待蛋白质的变性和凝固作用（从生命现象、人类生活和生产各方面考虑）？2、蛋白质的变构效应（别构效应） 多亚基蛋白质（四级结构）中的一个亚基空间结构的改变会引起其它亚基空间结构的改变，从而使蛋白质功能和性质发生一定的改变，叫蛋白质的变（别）构效应。 蛋白质空间结构与功能的关系举例：1、折叠病。2、疯牛病。 3.4 蛋白质的理化性质一、分子质量测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法-超离心法 三、胶体性质 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 2）带相同电荷（双电层） 。五、蛋白质的电泳电泳的速度取决于蛋白质颗粒大小和所带电荷的多少。1.盐析 向蛋白质溶液中加入大量中性盐如NaCl、KCl、Na2SO4等时，可产生两种现象：盐溶：在盐浓度很低的范围内，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度也随之增加，这种现象称为盐溶。 机理：蛋白质表面电荷吸附盐离子后，增加了蛋白质和水的亲和力，促进了蛋白质的溶解。盐析：与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，形成沉淀析出，这种现象称为盐析。 机理：在高浓度的中性盐作用下，蛋白质胶粒的水化层被破坏，其电荷也被异性离子所中和，蛋白质胶粒失去这两种稳定因素后便发生聚集沉淀。 2.有机溶剂沉淀 有机溶剂也可以使蛋白