糖网清汤对糖尿病大鼠血糖、血脂及视网膜影响的研究.doc

陕西中医学院2011级硕士研究生报告陕 西 中 医 学 院硕士研究生学位论文开 题 报 告 书课题 名称糖网清汤对糖尿病大鼠血糖、血脂及视网膜影响的研究研究生姓名导师 姓名专 业中医五官科学研究 方向糖尿病视网膜病变性的临床研究入学 时间2011年9月一 选题的目的与意义糖尿病性视网膜病变(Diebetic Retinopathy,DR)是指糖尿病患者因高血糖的原因导致全身各组织器官的微血管发生病变，毛细血管的周细胞坏死，随后内皮细胞亦变薄，内屏障功能受损，血管内的血液成分由管内渗漏到组织中，造成视网膜病变和功能障碍。糖尿病可导致眼部各个组织发生病变，而视网膜病变是糖尿病眼病不可逆盲的最严重的并发症。高血脂与糖尿病性视网膜病变是密切相关的。人体血液中脂肪类物质增加，脂肪又可以转化成糖分，如果这些糖分在一定的时间内没有得到相应的消耗，便引起了糖尿病。长此以往使眼底微血管发生病变，血管壁发生异常造成出血与渗出，最终导致失明，我国糖尿病患者中DR的患病率达44%-51%。除了长期高血糖是产生DR的原因外，高血脂，高血压均是发生DR的危险因素。中医认为导致糖尿病性视网膜病变的原因是：气阴两虚，气虚渐重，燥热愈盛，瘀血阻络所至，故导师寇宁教授基于糖尿病视网膜病变的病症特点，以中医理论及现代中医药研究为指导，经过多年倾心研究并结合多年临床经验认为络脉瘀阻是导致糖网病变的主要病机，在此基础上确定了益气养阴，通络明目的治疗大法，组方糖网清汤。进行临床观察具有一定疗效。因此，本研究应用糖网清汤对实验大鼠进行实验研究，探讨糖网清汤对大鼠血脂的影响并观察视网膜及血管形态学的改变，从而进一步提供糖网清汤在治疗DR的作用机理，为糖网清临床应用提供更佳的理论实验支持。二 选题依据2.1西医理论研究进展 高血糖与糖尿病性视网膜病变密切相关，有可能是糖尿病人视网膜病变发生及发展的主要机制之一。高血糖与糖尿病性视网膜病变发生的关系，尚无肯定的结论，但大量资料证实，糖尿病患者的血糖水平越高，发生糖尿病性微血管病变的频率就越大。晚期糖基化终末产物的聚集量与糖尿病性视网膜病变的严重程度密切相关。根据近年来的深入研究，长期高血糖引起机体内过量的晚期糖基化终末产物的堆积，可能导致各系统的慢性病变和功能丧失。血液流变性失调导致血液在微血管中的流动减慢及其对血管壁的损伤在糖尿病性视网膜病变中起了重要作用。视网膜微血管内皮细胞损伤释放的内分泌物质可能在糖尿病性视网膜病变发生发展中起重要作用。内皮素增多使得新生血管大量产生。内皮素是目前所知作用最强、持续最久的缩血管物质，在生理情况下，血中内皮素水平很低；在缺血、缺氧等病理情况下，内皮素异常表达和释放是某些疾病发生发展的重要环节。血管因子增多使新生血管的危害加重。血管因子是一类多功能的强效细胞生长调节因子，视网膜有许多血管内皮细胞增殖因子和增殖抑制因子。总之，糖尿病性视网膜病变的发病是一个很复杂的病理过程。它可能是多因素、多阶段作用的结果。一般认为，持续几年的高血糖是糖尿病性视网膜病变发生的先决条件。先有代谢的损害，然后才是微血管损害。在高血糖的刺激下，通过干扰肌醇代谢及形成晚期糖基化终末产物，影响细胞Na-K-ATP酶活性。提高毛细血管的渗透性，使基底膜增厚重晚期糖基化终末产物堆积，毛细血管腔缩窄，视网膜缺血，释放血管增殖因子，促进新生血管形成，发展为增殖性糖尿病性视网膜病变。2.2西医药物治疗研究进展2.2.1长期控制糖尿病：糖尿病性视网膜病变的根本治疗是治疗糖尿病。2.2.2降低血脂：对于血脂偏高和视网膜黄斑区及其周围有环形硬性渗出的糖尿病患者，应摄取低脂饮食，并应用降血脂药物：如氯贝丁酯有类似效果。曾有报道服用氯贝丁酯250mg/次，4次/d，有减少视网膜渗出及提高视力的作用。2.2.3控制血压：血压升高可加重糖尿病性视网膜病变，当高血压得到控制时，荧光渗漏显著减轻，故应对糖尿病合并高血压病的患者控制血压。口服血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利50mg，2次/d，对糖尿病性视网膜病变有减轻作用，这可能与它抗高血压作用有关。2.2.4 导升明(doxium)：据称导升明(2，5-二羟基苯磺酸钙)对导致糖尿病性视网膜病变的“三高”因素：即毛细血管高通透性，血液高黏滞性，血小板高活性有明显的抑制和逆转作用。2.2.5 阿司匹林：可抑制血栓素和前列腺素代谢产物生成，抑制血小板凝集，对微血栓形成有一定的预防作用。常用300mg/次，1次/d，口服，预防视网膜病变的发生。2.2.6 抑制新生血管形成的药物：1:血管内皮因子抑制剂：阻断其刺激血管内皮细胞增殖，进而阻止新生血管的形成。2:蛋白激酶c抑制剂：可有效的控制蛋白激酶C受体的水平，防止阻止缺血缺氧，防止新生血管形成。3:包括碳酸酐酶抑制剂及血管紧张素。4:皮质类固醇类：能有效的消除弥漫性黄斑水肿，并使活跃的新生血管消退.2.2.7手术方法包括：1：利用激光的热效应行激光眼底光凝术。2：冷凝治疗 冷凝主要用于不适合做光凝治疗的病人或光凝治疗的补充疗法，如病人有屈光间质混浊或视网膜周边部病变光凝无法治疗。3：玻璃体切割术 对于糖尿病性视网膜病变，玻璃体切割术的基本适应证是玻璃体出血及严重的增殖性病变。2.3中医理论及中医药治疗研究进展2.3.1消渴目病，为消渴日久，肝肾俱虚，阴损及阳，目窍失养，而因虚致瘀，瘀血内停，目络阻滞，精气不能上荣，则目无光彩，视力降低，患者感觉黑花茫茫，云雾动荡，外观端好，甚则可突然失明。2.3.2治疗方案阴虚燥热 症状：视物不明，两目干涩，烦渴多饮，舌红少苔，脉弦数。辨证分析：烦渴日久，阴津不足，虚热内生，上犯于目，目睛受扰，润濡不足，故两目干涩，视物不明；阴液亏虚，津不上承，故烦渴多饮；舌红少苔，脉弦数为阴虚有热之象。治法：滋阴清热，泻火明目。（1）内服中药: 加味一贯煎。沙参15g 麦冬15g 枸杞子20g 川楝子15g 当归15g 生地15g 黄芩10g 黄连5g 丹参20g 葛根15g 菊花15g（2）电脑糖尿病治疗仪穴位针刺：章门,天枢,大都,公孙,太溪,三阴交,陷谷,足三里,中脘,合谷（左）气阴两虚 症状: 视物昏花，神疲乏力，头晕耳鸣，腰膝酸软，舌黯淡, 脉细弱。辨证分析：消渴日久，伤阴耗血，元气不足，肝肾亏虚，故神疲腰软；气阴两虚，元气不能充养头目耳眼，故视物昏花，头晕耳鸣；气阴两虚，津液不足，故见口干；舌淡黯，脉细弱，为其气阴不足之象。治法：益气养阴，明目通络。（1）内服中药: 明目汤加减或明目丸。 山茱萸15g 熟地黄30g 山药15g 泽泻15g 牡丹皮10g 茯苓25g 菊花15g 枸杞子15g 石菖蒲15g 丹参20g（2）电脑糖尿病治疗仪穴位针刺：章门,天枢,大都,公孙,太溪,三阴交,陷谷,足三里,中脘,合谷（左） 痰湿瘀阻型 症状：双目云翳，昏花，粘滞，胸脘胀闷，食欲不佳，舌淡胖或黯淡，苔白腻，脉弦滑。辨证分析：消渴日久，脾胃受遏，而生痰湿，气机不畅，清阳不升，浊阴不降，是故双目粘腻，多垢；痰蒙睛明，可见双目云翳；痰湿中阻，脾胃失运，故脘腹胸胁满闷，纳差食少；其舌淡胖，苔白腻，脉弦滑为痰湿中阻，气机不畅之象。治法：健脾和胃，化痰散瘀。方药： （1）温胆汤加味半夏15g 竹茹15g 白术20g 枳实10g 茯苓25g 陈皮15g 丹参20g 葛根15g 谷精草20g 密蒙花20g（2）电脑糖尿病治疗仪穴位针刺：章门, 天枢, 大都, 公孙, 太溪, 三阴交, 陷谷, 足三里, 中脘, 合谷 （左）2.4糖网清汤的组方依据和作用与功效 功效：益气养阴，活血通络，明目。 方义：本方重用生黄芪甘温补气，升提固摄，即可补脾胃中气，促气旺血行，瘀血通络，又可固摄经络真气以除，熟地、枸杞滋阴益精。气因双补，当归有活血养血作用使祛瘀而不伤血，共为臣药。佐以赤芍、川穹、桃仁，茺蔚子助当归活血祛瘀，又佐以性善走穿之地龙，通经活络，力专善走，周行全身，以行药力，诸药合用，则气旺血行，瘀消络通，诸症可愈，特点：补气药与活血药相伍，以大补元气为主，活血通络为辅，使血旺则血行，且补气而不雍滞，祛瘀而不伤血。从而对视网膜血管壁有保护作用，改善血液的高凝状态，减少血管渗出及出血，保护视网膜，提高视力作用。 生黄芪补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌，增强机体耐缺氧及应激能力，调节血糖，促进机体代谢降压等作用，地龙：具有通经活络、活血化瘀，川芎的功能主治:活血，散瘀，理气，止痛。当归既有补血和活血作用还有通经活络作用，桃仁具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘，熟地具有补血滋阴作用，可用于血虚萎黄，亦可用于肾阴不足，充蔚子具有活血调经，疏风清热。赤芍具有清热凉血；活血祛瘀，补肾益精，养肝明目，补血安神，生津止渴，润肺止咳。三 实验部分3.1实验药物糖网清汤由生黄芪 地龙 川芎 当归 桃仁 熟地 茺蔚子 赤芍 枸杞子组成（所用的药材全部由陕西中医学院药学院药剂科提供。）3.2实验动物及实验方法：3.2.1. 材料实验动物动物选择：本实验选用成年雄性SD（清洁级）大鼠60只，体重约200+20g，年龄大约相同，眼部无异常病变，由沣渭实验动物中心提供。动物饲养要求：所有实验大鼠均在实验室内采取自由饮水和自然昼夜自然光照。并符合动物饲养室二级标准。适合大鼠健康生长条件，分笼饲养，专用大鼠饲料。排除检查：实验前在眼底镜及裂隙灯下观察大鼠的屈光间质及网膜血管功能情况，保证实验的准确和成功性。3.2.2实验药品及器械耗材糖网清汤：生黄芪30g、桃仁6g、地龙6g、川芎6g、枸杞子10g、当归10g、赤芍10g、熟地10g、茺蔚子10g，水煎，浓缩后按照比例模式计算出大剂量1.95 g/ml、中剂量1.30 g/ml、小剂量0.65g/ml,放入4冰箱冷藏保存备用。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：美国Sigma公司多贝斯胶囊(羟苯磺酸钙)：规格0.5g20粒，产地：西安利君制药有限责任公司,枸橼酸：重庆川江化工试剂厂；枸橼酸钠：成都市联合化工试剂研究所冰醋酸（分析纯，乙醇99.5）：陕西中医学院中心实验室提供 双蒸水：陕西中医学院中心实验室提供糖化血红蛋白试剂盒：法国BIO-KAO生产血脂四项测试试剂盒：北京康大泰科医学科技有限公司制造主要医学仪器：糖化血红蛋白测试系统：日本东子公司 型号：TBA-120FR血脂分析仪：北京康大泰科医学科技有限公司制造电子精密天平：上海精密科学仪器有限公司，型号：FA1004N。 电冰箱：西门子公司，型号：KK25F68TI。 OLYMPUS，BX40显微镜：日本生产。 OLYMPUS全自动显微镜照相装置：PM10AD型，日本生产 眼科手术显微器械 ：苏州医疗器械总厂 手术显微镜：苏州医疗器械总厂 随手测TM型血糖仪：三诺安稳免调码型血糖仪， 可见光分光光度计：上海光谱仪器公司，型号723 电热恒温水浴锅：上海恒科仪器公司，型号DK-8AD型 KDC-40台式低速离心机：科大创新股份有限公司，型号KDC-40 微量式移液器：苏州医疗器械总厂。3.2.3实验方法：大鼠适应性喂养7日，将10只大鼠设为空白组，并将剩余的50只设为模型组，试验性腹腔注射配置好STZ(65mg/Kg)溶液，复制DR大鼠模型，给药3 d 后血糖仪测定大鼠尾末梢全血的空腹血糖值，以空腹血糖值16.65 mmolL为DR大鼠模型造模是否成功标准。3.3 实验分组 将50只造好的DR大鼠模型随机分组1组：多贝斯组，（按照每公斤体重120mg， 1组每天固定上午10时灌胃一次，连续90天。）2组：大剂量糖网请组，3组：中剂量糖网请组，4组：小剂量糖网请组，（2、3、4组每日上午10时糖网清汤药物灌胃1次，连续90天。）5组：糖尿病组模型，6组：空白对照组，（5、6组每日上午10时等量生理盐水灌胃给药，每天给药一次，连续90天。）3.4 检测指标 观察所有实验大鼠体重，血糖，行为状态，体征，摄食量，饮水量，尿量，等变化。间隔30天给大鼠2 %戊巴比妥钠溶液40 mL/kg腹腔注射麻醉，腹股静脉取血，测量大鼠的体重及空腹血糖各一次。给药90天实验大鼠麻醉后心脏采血10ml，分离血清，测量糖化血红蛋白，及血脂四项包括（总胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白）。 3.5 组织病理学观察 固定液的配置方法：将准备好的4g多聚甲醛加入80ml磷酸缓冲液中，加入数滴1N的NaOH（PH7.4）,60度的水浴持续搅拌至完全溶解。待到冷却后，分别加入1,2,5,20ml的甲醛（最终浓度1%，2%，5%，20%），用PBS缓冲液补足至100ml。取材和固定：将选取的雄性大鼠经过过量乙醚麻醉处死后立即取出眼球（保留球后神经长约5mm），将取出的眼球投入到固定液中室温下固定0.5h，待眼球表面变硬后取出下方一半的角膜，投入到固定液中固定24h，常规脱水，按照眼球前后径水平方向用60摄氏度的石蜡包埋，常温条件下自然冷却，室温保存待切。切片和染色：用轮转式切片机连续切片，深度以切到视神经和角膜在同一水平线为宜，厚度约4m，42摄氏度水浴并且展开铺平，5摄氏度烘烤切片3h以上，常规（苏木精 伊红染色法）HE染色，封片。HE染色的图像采集：将每个组织学切片分别采用OLYMPUS全自动显微镜400倍视野观察视网膜各层结构及血管形态学的改变并且照相。四 统计方法运用SPSS18.0计算软件统计分析实验结果，并以均数标准差（S）表示，各组间差异采以方差方式分析，有统计学意义再进LSD法进行间间比较，用q检验，相关分析用t检验和x2检验，以P0.05为差异有统计学意义。五 本课题立题可行性5.1 本课题因血脂增高而造成的糖尿病性视网膜病变具有明确的理论依据，故研究糖网清汤对糖尿病大鼠末梢血血脂的影响具有科学依据。5.2 本课题研究总体费用较少，可以在承受范围之内，这个也是保证研究成功的条件。5.3本实验老师为研究出糖网清汤的寇宁主任医师，她本人临床工作近30年在糖尿病性视网膜病变临床研究方面有很深的造诣。六 可能出现的情况及措施6.1可能因为认为原因造成不必要的误差，严格按照科学方法进行。6.2在给大鼠灌胃过程中可能造成窒息等，所以要求我们多思考，用什么样的办法能避免这样的情况。6.3麻醉药品的计量不容易控制，有可能导致过量死亡或者计量不够影响操作，故一定要选用安全性相对较好及效果较明显的麻药。6.4眼球的解剖结构非常重要，故一定要了解清楚，以利于眼球切片及HE染色组织后的分析研究。6.5遵循科学原理，尽量不走弯路，花最少的代价，取得最好的效果。七 预期进度2012.12-2013.3 查阅资料实验准备阶段2013.4-2013.7实验阶段（造摸、分组观察）2013.8-2014.1实验数据整理、撰写毕业论文2014.5论文答辩八 经费预算实验动物及饲料费 3000元实验药品 1000 元试剂费1000元水电费 100元设备使用费 1000元器械费 200元耗材费 400元检测费 1000元 交通及打印资料费 400元 总计8200元九 参考文献1葛