表皮生长因子复合可降解胶原膜防止鸡鞘管区肌腱粘连的实验研究.doc

表皮生长因子复合可降解胶原膜防止鸡鞘管区肌腱粘连的实验研究王继宏 温树正（内蒙古医学院第二附属医院手外二科 内蒙古 呼和浩特010030）摘要 目的 观察和探索表皮生长因子复合胶原膜在预防鞘管区肌腱粘连、促进肌腱内源性愈合中的作用。方法 将30只10月龄雄性leghorn鸡随机分为A、B、C 组，每组10只。将每只鸡的左足第三趾造成挤压撕脱伤模型，用改良Kessler缝合法缝接。A组:断端包裹复合有EGF的胶原膜；B组:断端只包裹单纯的胶原膜；C组:断端不加任何处理。术后4周,对标本进行肉眼观察、生物力学测试、光镜、电镜等观察。结果 A组肌腱粘连程度较轻，腱缝合段内的胶原纤维数量多,以粗大的型胶原为主；成纤维细胞数量少，腱细胞成熟。B组肌腱粘连较轻，但腱缝合段内的胶原纤维数量少, 排列稀疏，以纤细的型胶原为主； C组肌腱与周围组织粘连重，腱缝合段内的胶原纤维数量较多, 排列紊乱，、型胶原交错排列。结论 1、可降解胶原膜能起到屏障肌腱外源性愈合、防止肌腱粘连的作用，但同时也明显减慢了肌腱的愈合速度。2、EGF复合可降解胶原膜, 既能起到屏障肌腱外源性愈合、防止肌腱粘连的作用，同时EGF也加快了肌腱的内源性愈合速度，起到了较理想的防止粘连的效果。【关键词】表皮生长因子 胶原膜 肌腱粘连 实验研究An experiment study of EGF combined with degradable collagen membrance in prevention of tendon adhesion in chicken.Wang ji-hong Wen shu-zheng .Department of hand surgery,Inner mogerlion medical collage NO 2 hospital,huhehaote ,010030,china .Objective To study the adhesion-preventing effect of epidermal growth factor(EGF)combined with degradable collagen membrane，and its effect of improving tendon regeneration inside . Methods Thirty ten-month old fowl were randomly divided into groups A,B and C (10 each group).Cut off the flexor tendon in the third toe then suture it .In groupA,sutured flexor tendon in zone were encapsulated with EGF combined with degradable collagen membrane; in group B,sutured flexor tendon were encapsulated with degradable membrane alone; in group C, no EGF or degradable membrane applied. Four weeks later, the specimens were evaluated by means of macroscopic observation, vitodynamics test, light microscope and electron microscope. Results In group of A ,There were a large amount of collogen inside the sutured tendon ,they were closely and and line up in order.The amount of collagen-fibronectin was less than that in groups C (P0.01) and the adhesion obviously was less than the control tendons, The peripheral tissue in group A almost remains as the formal loose connective tissue,it was in the advanced stage of tendon regeneration. In group A ,there were a large amount of collogen inside the sutured tendon ,they were loosely and well organized. The peripheral tissue in group B almost remains as the formal loose connective tissue,it was in the earlier stage of tendon regeneration; In group C, a disorder of fiber was found in this group . Further more, the peripheral tissue became compact connective tissue and grew into the tendon. The amount of collagen-fibronectin was larger than that of groups A and B . The tendon regeneration is in the middle stage. Conclusion EGF combined with degradable collagen membrane can improve the tendon regeneration inside and prevent the formation of adhesion.【Keywords】 EGF ；collagenmembrane ；Tendon adhesion ；experimental study肌腱损伤是手外科常见的问题之一。特别是屈指肌腱II区损伤，由于修复或移植术后总是发生粘连,使肌腱滑动受限,严重影响手功能的恢复,因此,肌腱损伤的修复仍然是手部创伤与功能重建领域的一项重要课题。本实验旨在观察和探索表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）复合可降解胶原膜在防止鸡鞘管区肌腱粘连中的作用。材料与方法选取实验用10月龄雄性健康leghorn鸡30只,体重2.0-2.1Kg。随机分成3组,每组10只。氯胺酮50/肌注麻醉2%利多卡因趾根麻醉,俯卧左足后伸直位固定于手术板上,常规消毒铺单。Z形切开左足第趾掌侧皮肤，游离趾深屈肌腱横形切断，用改良的Rothkopf和Perterson实验性损伤法1造成挤压挫裂伤模型，用5-0尼龙线改良Kessler缝合法吻合断端。80尼龙线间断缝合外周，切除吻合段腱鞘5mm。A组吻合口包裹EGF胶原膜，B组只包裹单纯的胶原膜，C组不包裹药膜，缝合皮肤，术后屈趾位管形石膏固定3周，分笼饲养。术后4周后取材进行肉眼观察、生物力学测试、光镜、电镜观察。图4图3图2图1图1：5-0尼龙线改良kessler法缝合肌腱；图2：局部包裹胶原膜并吸附EGF图3：将胶原膜与腱鞘缝接； 图4：吻合后的胶原膜结 果1、 肉眼观察：A，B组4周时偶可见未降解完全的胶原膜碎片，腱周可见薄膜状假鞘包绕，两端与腱鞘相延续,薄膜下腱周间隙有少量滑液样液体。腱吻合处略膨大,表面光滑,与周围组织无粘连或轻微疏松粘连。C组4周时腱吻合处可见致密粘连 ,钝性分离较困难。2、关节屈曲总角度及肌腱滑移距离测定实验鸡处死后,将左腿于膝关节处解脱,固定于测试台上,于足跟处分离出第趾的趾深屈肌腱,加以500g的拉力牵拉趾深屈肌腱,使鸡趾由180伸直位逐渐屈曲,测量该趾远、近趾间关节和跖趾关节的屈曲角度,如实验趾不能完全伸直，则减去伸直受限的角度。同时测量肌腱滑移距离，见表2。从表中数据可以看出，A组与B组的肌腱总屈曲角度和肌腱的可滑动距离，均明显优于对照组C组，经方差分析， A、B组与C组间关节总屈曲角度及肌腱滑动距离有显著差异， A组与B组间差别无统计学意义。说明单纯胶原膜组和胶原膜复合EGF组都可减轻肌腱的粘连。表格 2肌腱屈曲总角度及滑动距离（s）组别n关节屈曲总角度 肌腱滑动距离（mm）正常组10204.921.4824.992.01A组10115.144.47*19.775.35*B组10117.544.91*18.343.59*C组1068.436.4313.133.28F值22.44216.817P值p0.05p0.05*表示与C组比较P0.05;正常组与A,B,C三组比较p值均0.053、HE染色 正常组可见腱细胞稀少，且排列规则，肌腱与腱鞘分界明显，腱周可见明显的空隙，脏、壁层有滑膜覆盖；A组可见成纤维细胞少，细胞核体积小、梭形，成行排列，接近于成熟的腱细胞。肌腱与腱周组织有明显的腱周间隙，间隙的相对面可见复层扁平上皮细胞覆盖；B组成纤维细胞胞核大，排列整齐，未见有腱周组织长入肌腱内部，肌腱与腱周组织有间隙，间隙的相对面可见复层扁平上皮细胞覆盖；C组成纤维细胞数量明显较A、B两组为多，胞核体积大，腱周的成纤维细胞参与肌腱愈合，长入肌腱内部，肌腱与腱周无明显分界，形成致密的粘连。图4图3图2图1 图1：正常组纵切面肌腱与腱周可见明显的滑膜间隙；图2：A组肌腱与腱周可见滑膜间隙图3：B组肌腱与腱周可见明显的滑膜间隙；图4：C组肌腱于腱周相连，无滑膜间隙4、型胶原免疫组化染色: 型及型胶原纤维被染成棕黄色，正常组型胶原呈强阳性，型胶原几乎无染色；A组型胶原呈强阳性，型胶原为弱阳性；B组型胶原为强阳性，型胶原为弱阳性；C组型胶原为强阳性、型胶原为弱阳性；经图像分析仪测定各组之间型及型胶原纤维在每高倍镜视野下所占面积的百分比（见表5）。可以看出， A组肌腱愈合质量佳，胶原纤维以粗大的型胶原居多， C组的型胶原含量也较多，但排列杂乱无章，单纯胶原膜组的胶原纤维以纤细的型胶原为主，与A、C两组对比差异有显著性。图1图4图3图2图1：正常组纵切面型胶原染色呈强阳性；图2：A组纵切面型胶原染色阳性呈强阳性图3：B组纵切面性胶原染色呈弱阳性 图4：C组纵切面型胶原染色强阳性但胶原纤维排列紊乱表格5免疫组化染色型、型胶原在每高倍镜视野下所占面积的百分比（）（s）组别n型胶原（）型胶原（）正常组1090.582.6311.434.28A组1083.255.7222.565.58B组1025.575.6270.848.50C组1058.048.3632.407.56F值244.261148.813P值P0.05P0.05经两两分析各组间P值均0.055 超薄切片透射电镜观察：正常组4800倍下可见腱细胞呈梭形，细胞核呈长杆状，核仁明显，36000倍下可见细胞器不发达，数量少，模糊不清，隐约可见；胶原纤维粗大，排列整齐、致密，周期性横纹明显（见附图8）；A组4800倍下可见腱细胞呈梭形，胞核长杆状，核仁明显，36000倍下可见细胞器不发达，数量较少，呈功能不活跃状态，胶原纤维较为粗大，排列较整齐，可见周期性横纹，处于肌腱修复晚期改变（见附图8）；B组4800倍下胞核呈圆形或椭圆形，核仁不明显，可见有丝分裂象，36000倍下可见胞浆内细胞器发达，细胞器成分多,见大量增生呈球状扩张的粗面内质网、线粒体和溶酶体。尤以粗面内质网、高尔基体、多聚核糖体最为发达，显示细胞具有活跃的分泌功能。胶原纤维纤细、呈短节段，排列稀疏，周期性横纹模糊。处于肌腱修复早期改变（见附图8）。C组4800倍下胞核呈长椭圆形，核仁不明显，36000倍下胞浆内粗面内质网众多，但无明显扩张。胶原纤维较B组粗大，数量较多，但排列紊乱，周期性横纹模糊，处于肌腱修复中晚期改变（见附图8）。图5图3图2图1图4图8图7 图6 图1：正常腱细胞内细胞器不发达，数量少，处于功能静止期36000。 图2：A组细胞器数量少，模糊不清，处于功能相对静止期36000图3：C组细胞器发达、数量多但无扩张，功能较活跃36000 图4：B组细胞器高度发达，呈球形扩张，功能活跃36000图5：正常肌腱胶原纤维粗大，排列整齐、致密，横纹明显36000 图6：A组胶原纤维较粗大，排列整齐，可见横纹36000图7：C组胶原纤维数量多，较粗大，可见横纹但排列紊乱36000 图8：B组胶原纤维稀疏，横纹不清36000讨 论关于肌腱的愈合,曾存在两种相反的观点,20世纪上半叶，大家普遍认为肌腱的愈合是外源性愈合,愈合过程是由成纤维细胞介导,在腱和腱周组织之间粘连形成的结果。所以肌腱的愈合和粘连是同时发生的，粘连是不可避免的2。持内源性愈合观点者认为肌腱细胞本身具有再生能力，可增生和分泌胶原，修复损伤的肌腱3。而近年来的研究表明,肌腱既存在外源性愈合,又存在内源性愈合4。哪种愈合方式占主导地位,取决于肌腱内外的营养状况和环境条件 5。我们认为，肌腱本身具有腱细胞，损伤后，腱细胞转化为成纤维母细胞，进行增殖、分裂，完成自身的修复，即肌腱的内源性愈合。然而，由于鞘管区肌腱自身的腱细胞数量少、血运不丰富，而其周围的结缔组织中具有丰富的血运及数量较多的成纤维细胞，因此，肌腱损伤后这些细胞很快长入断端，并分泌合成大量的胶原纤维，参与肌腱的愈合，使肌腱与周围结缔组织愈合在一起，形成粘连。因此外源性愈合是肌腱粘连的根本原因。因此我们在实验中设计了C组，在肌腱缝合后未加任何干预措施任其自然愈合，在术后4周时肉眼观察：腱吻合处可见致密粘连, 钝性分离较困难；免疫组化染色染色见成纤维细胞和胶原纤维数量多但分布杂乱无章、互相交错，与周围组织明显粘连，无腱周隙；超微切片观察，腱细胞内细胞器发达但无扩张，胶原纤维较粗大但排列紊乱，相互交错，处于肌腱修复晚期。以上结果表明，肌腱损伤后自然愈合时腱周成纤维细胞参与了肌腱的修复，肌腱的愈合是由内源性愈合和外源性愈合共同完成的，肌腱愈合速度较快，4周时已有大量的胶原纤维形成，但同时也形成了致密的粘连。因此如何控制外源性愈合、促进内源性愈合，是减少肌腱粘连的重要途径。基于上述理论的发展，近年来很多学者采用玻璃酸钠、高分子纤维素、几丁糖、医用生物蛋白胶等液态分子生物材料作为屏障预防粘连发生6-9，取得了一定效果，但存在着液态药物降解快、流失量大、屏障作用不理想等问题。因此现在研究者们越来越多的倾向于膜态屏障材料的研制开发，但是关于预防肌腱粘连的最佳材料的选择问题仍然还需要进一步探索比较。因此本次研究设计了B组，在损伤肌腱缝合处单纯包裹胶原膜，实验结果表明：1、术后4周时胶原膜已吸收，偶可见未完全降解的胶原膜碎片，说明膜降解速度与组织再生完成的时间匹配(约34周)，避免了因降解过快而造成屏障作用不理想的问题。 2、肉眼观察本组鸡趾无明显肿胀，切口处无感染，切开后肌腱局部无炎性反应及坏死组织，且在光镜下无明显的淋巴细胞浸润，说明胶原膜在鸡趾的局部未引起明显的免疫排斥及异物反应。3、关节总屈曲度及肌腱滑动距离均明显优于C组，说明胶原膜的防粘连效果好。4、组织切片及免疫组化染色可见肌腱损伤缝合处成纤维细胞数量少，胶原含量少，在4周时胶原纤维仍以短节段、纤细的III型胶原为主；腱细胞的超微结构显示细胞器成分多,可见大量增生扩张的粗面内质网、线粒体和溶酶体，细胞器功能活跃，胶原纤维细小，稀疏，处于肌腱愈合早期。以上结果表明肌腱损伤处置入胶原膜后阻止了腱周结缔组织长入肌腱内部，起到了屏障作用，但因其同时屏障了肌腱的外源性愈合，因此其愈合速度较其他两组慢。随着分子生物学的发展，学者们发现多种生长因子（EGF,bFGF,IGF,TGF,PDGF）10能够促进腱细胞生长、增殖、合成蛋白质或多肽。在肌腱损伤后,腱细胞在多种内源性的生长因子作用下增殖分化,促进胶原的合成，从而促进了肌腱的内源性愈合。但究竟哪一种因子是肌腱愈合的特异性因子，也是目前学者们研究的焦点之一。许多科学家发现EGF对多种细胞都有强大的促进生长作用，其生理功能主要有11：、促进上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等的增殖、促进透明质酸、纤维连接蛋白、糖蛋白和羟脯氨酸、胶原酶等胞外基质的合成，从而促进胶原合成和分泌、沉积、调节胶原降解及更新，增强胶原纤维抗张强度，减少疤痕形成，提高愈合质量。美国学者Jann曾在1999年将EGF复合于可吸收缝合线用于鸡屈趾肌腱的吻合12，结果显示EGF可促进腱细胞增殖，促进胶原合成和分泌。提示EGF 在肌腱愈合过程中发挥重要作用。因此我们在实验中设计了A组，在肌腱损伤缝合处包裹复合有EGF（2000IU/ml）的胶原膜，实验结果表明：4周时腱吻合处胶原膜已吸收，腱周可见薄膜状假鞘包裹（见附图2图g），此膜两端与腱鞘相延续,薄膜下腱周间隙有少量滑液样液体。腱吻合处略膨大,表面光滑,与周围组织无粘连或轻微疏松粘连。肌腱总屈曲度及滑动距离均明显优于C阻，组织切片光镜下可见腱细胞数量少，但胶原纤维数量多且排列整齐、致密，而且以粗大的I型胶原为主。透射电镜下可见腱细胞细胞器数量少，形态模糊，细胞器功能不活跃，但胶原纤维粗大、排列整齐，结构清晰，周期性横纹明显，处于肌腱修复晚期，以上结果表明，复合有EGF的胶原膜既能屏障外源性愈合，防止肌腱粘连，同时EGF又能促进肌腱的内源性愈合，提高肌腱的愈合速度及愈合质量。4结论 1、可降解胶原膜能起到屏障肌腱外源性愈合、防止肌腱粘连的作用，但同时也明显减慢了肌腱的愈合速度。2、EGF复合可降解胶原膜,既能起到屏障肌腱外源性愈合、防止肌腱粘连的作用，同时EGF也加快了肌腱的内源性愈合速度。起到了较理想的防止粘连的效果。参考文献1 Rothkopf DM, et al. Experimental model for the study of canine flexor tendon adhesion. J.Hand Surg (Am)，1991; 16(2):694-6982 陈至善，王立飞.透明质酸钠防止屈肌腱粘连的实验研究J.中华外科杂志，1995;33（9）:527-529.3 Mass D P,Tuel R J.Intrinsic healing of the laceration site in human superficialis flexor tendons in vitroJ. Hand Surg,1991;16(1):24-26.4 Seiler JG,Gelberman RH,Williams CS ,etal. Autogenous flexor tendon grafts.J. Bone Joint Surg,1993; 75(1): 1004-1008.5 Silva MJ, Boyer MI, Gelbe