第四章+DNA的生物合成.doc

第四章 DNA的生物合成DNA复制的特点1、半保留复制2、复制的起始，方向与速度3、半不连续复制4、DNA聚合酶催化，多种蛋白质参与一、 半保留复制 P514半保留复制DNA在复制时，以亲代DNA的每一条链为模板，按碱基互补原则，分别合成新链，每个子代DNA中都含有一条亲代DNA链。三种可能的DNA复制机制二、 复制的起始，方向与速度DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始位点(origin) 。复制起始位点序列特征：富含AT，具有复制起始蛋白识别的区域。 独立完成复制的功能单位称为复制子(replicon) 。 DNA复制的起始，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，RNA引物的序列与模板DNA的碱基顺序相配对。 DNA复制大多为双向等速复制。三、 半不连续复制 DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的前进方向必须是35。 复制时，1条链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，可连续合成，称为先导链(leading strand)，另一条链的前进方向与复制叉打开方向相反，不能连续复制，称为滞后链(lagging strand)。所以DNA的复制是半不连续复制。 滞后链的复制过程: 先以片段的形式合成冈崎片段，多个冈崎片段再连接成完整的链。四、DNA聚合酶催化，多种蛋白质参与（一）、DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA pol）活性：1. 53 的聚合酶活性聚合反应： 底物dNTP 2. 核酸外切酶活性DNA聚合酶的核酸外切酶活性 3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 3外切酶活性切除突变的 DNA片段与冈崎片段中的引物。DNA聚合酶的种类 在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ）。参与DNA复制的主要是pol 和pol 。原核生物中的三种DNA聚合酶pol pol pol 53聚合酶活性+53外切酶活性+-35外切酶活性+生理功能填补缺口修复损伤校正错误主要起修复作用复制先导链与冈崎片段校正错误 pol 可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenow 片段。 真核生物的DNA聚合酶DNA-polabgde分子量(kD)16.54.014.012.525.553聚合酶活性+?+35外切酶活性-+生理功能起始引发引物酶活性低保真度复制线粒体DNA复制延长子代链的主要酶,解螺旋酶活性填补缺口,切除修复,重组（二）、单链DNA结合蛋白（SSB蛋白） 单链DNA结合蛋白是一些能够与单链DNA结合的蛋白质，以四聚体形式与单链DNA结合，起保持单链的存在的作用。（三）、解链酶（helicase） 解链酶，又称解旋酶，解螺旋酶 ，是用于解开DNA双链的酶蛋白。 延模板链移动，每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。（四）、DNA拓扑异构酶 ( topoisomerase) 能够松解DNA超螺旋结构的酶。 拓扑异构酶的作用特点能水解连接磷酸二酯键 （五）、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。滞后链冈崎片段的连接。第三节 DNA的复制的过程一、 复制的起始二、 复制的延长三、 复制的终止四、 环状DNA的复制五、 端粒与端粒酶 一、复制的起始 DNA复制的起始由两步构成。 1解旋解链，形成复制叉：A. DnaA蛋白识别复制起始序列，由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA双螺旋结构解开，形成两条单链DNA。B. 单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。2引发体组装和引物合成：A. 由解链酶(DnaB蛋白) 等6个蛋白装配成引发前体，并与引发酶(DnaG蛋白) 形成引发体；B. 在引发酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段作为引物，从而获得3端自由羟基（3-OH）。 引发体的组装形成含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。二、复制的延长 复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以亲代DNA链为模板，从53方向聚合形成子代DNA链。其化学本质是将dNMP逐个通过磷酸二酯键添加到子链3 末端羟基上。 在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。DNA延伸过程简图三、复制的终止 （一）去除引物，填补缺口： 在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除； RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶e（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。（二）连接冈崎片段： 在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。 四、环状DNA的复制过程 环状DNA复制有多种形式，比较常见的为q复制、滚环复制和D环复制。 q复制是通过Colin实验发现的。其特点是：复制起始后双向复制，得到2个环状子代DNA分子。 滚环复制特点（1）不需RNA引物（2）只有一个复制叉，单向复制（3）形成多联体（concatemer ）（4）一次起始可以合成多个子代DNA，效率高 采用滚环复制的DNA，大多为噬菌体DNA。 D环复制(D-loop replication) ：是线粒体DNA 的复制形式，其特点是：单向复制，两条链合成不对称，形成一个双链环状分子与一个部分单链环。五、端粒与端粒酶 链状DNA的末端问题：线状DNA，复制完成切去引物后，会产生5末端缺失。 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。端粒的结构特点由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短 序列。功能维持染色体的稳定性 保证DNA复制的完整性 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。端粒酶(telomerase) 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA（端粒酶RNA）为模板，通过反转录酶（端粒酶反转录酶）催化反转录反应对末端DNA链进行延长。反转录酶与反转录现象 反转录酶和反转录现象的发现理论意义：RNA兼有遗传信息传代与表达功能。应用意义：可人工合成cDNA及构建cDNA文库。第三节 DNA的突变一、基因突变的特征与意义二、基因突变的类别三、引起基因突变的原因一、基因突变的特征与意义 可以通过复制而遗传的永久性DNA结构的改变，称为基因突变（ Gene Mutation）。 其特征是：1. 基因突变在生物界中是普遍存在的；2. 基因突变发生频率很低；3. 基因突变是随机发生的；4. 基因突变是不定向的，有可逆性。 基因突变的后果与意义1. 突变导致表型的改变，严重的导致死亡（致死型突变，条件致死型突变）；2. 突变是很多疾病的发病基础；3. 大多数基因突变不产生个体的变化；4. 突变是进化的分子基础。二、基因突变的类型 DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)。多个碱基的改变称多点突变，也称复突变（multiple mutation) 点突变的类型1. 碱基替换: 一个碱基替换为另一个碱基转换发生在同型碱基之间。颠换发生在异型碱基之间。2. 碱基缺失：一个碱基从DNA大分子上消失3. 碱基插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。 缺失或插入都可导致框移突变。 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 复突变的类型插入 增加一段顺序。 缺失 减少一段顺序。 复突变 倒位 一段碱基顺序发生颠倒。 易位 一段碱基顺序的位置发生改变。 重排 一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换。 从对遗传信息的改变上定义，点突变还可分为三类：1.同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子。2.错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变。3.无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白合成的终止密码子（UAA，UAG，UGA）。三、引起突变的因素1. 自发因素： (1).自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。 (2).自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。 (3).复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。 2. 物理因素： 由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。如：X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。 3. 化学因素：(1).脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。 (2).碱基类似物：如5溴尿嘧啶等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。(3).烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基,如氮芥类，使鸟嘌呤甲级化，造成碱基缺失。(4).DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(5).断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。 4. 生物因素： 如病毒感染，转座子转位，质粒转化等因素都可能引起DNA序列发生改变。第四节 DNA的修复一、直接修复二、错配修复三、碱基切除修复四、核苷酸切除修复五、SOS修复 DNA损伤修复(repair) ：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。修复的主要类型：一、直接修复1. 光修复（light repair）： 通过光修复酶，可以修复因紫外线照射引起的嘧啶二聚体的DNA损伤。2. 烷基转移修复 通过甲基转移酶，对引起甲基化的DNA损伤进行修复 。二、错配修复 对DNA复制忠实性有很大贡献，依据“保存母链”原则，修复新合成子链中的错配。依据母链DNA中GATC序列中腺苷酸N6位的甲基化分辨母链与子链。 Cell杂志 2005年封面文章报道体外重建错配修复系统。错配修复机制参与蛋白与功能：MutS：识别突变位点MutS-MutL：寻找甲基化位点MutH：切断未甲基化链核酸外切酶：切除突变序列DNA pol III：修补缺口SSB蛋白，连接酶等三、切除修复1、碱基切除修复 针对受损碱基，常常由于自发突变造成。 步骤：1，糖苷水解酶特异性切除受损核苷酸N-b-糖苷键，在DNA链上形成去碱基位点（AP位点）。2，AP核酸内切酶切断磷酸酯键，并切去包括AP核酸在内的一小段DNA。3，DNA pol I填补缺口DNA连接酶连接2、核苷酸切除修复 针对核苷酸受损伤后无法形成氢键情况。 切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。