TALEN-小鼠-基因敲除流程.pdf

上海斯丹赛生物技术有限公司 SIDANSAI Biotechnology CO LTD 分 类 小 鼠 属 于 哺 乳 纲 Mammalia 啮 齿 目 Rodentia 鼠科 Muridae 小鼠属 Mus 动物 特 征 生长期短 成熟早 繁殖力强 性成熟 6 7周 雌性35 50日龄 雄性45 60日龄 体成熟 雌性为65 75日龄 雄性为70 80日龄 性周期为 4 5天 妊娠期为19 21天 哺乳期为20 22天 一 次排卵10 23个 视品种而定 每胎产仔数为8 15 只 一年产仔胎数6 10胎 属全年 多发情性动物 繁殖率很高 生育期为一年 小鼠 确定靶基因 筛选同源重组成功的ES 载体线性化导入ES ES显微注射囊胚 构建同源重组载体 野生型 F1代 杂合体 野生型 野生型 F1代 杂合体 F0代 嵌合体 F2代 纯合体 野生型 F2代 杂合体 同源重组介导的小同源重组介导的小 鼠基因打靶流程鼠基因打靶流程 确定靶基因 体外转录mRNA TALEN活性检测 将mRNA注射入一细胞期受精卵 构建TALEN载体 野生型 F1代 杂合体 野生型 小鼠3T3细胞 野生型 F1代 杂合体 F0代 嵌合体 F2代 纯合体 野生型 F2代 杂合体 TALEN介导的小介导的小 鼠基因打靶流程鼠基因打靶流程 注 KI加同源载体 Donor DNA Step1 设计设计TALEN打靶载体打靶载体 针对靶基因的两个不同位点分别设计一个2X3的TALEN组合 Spacer 12 21bp 5 5 3 3 Step2 构建构建TALEN打靶载体打靶载体 通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建 上游引物测序结果比对 下游引物测序结果比对 Step3 细胞水平细胞水平TALEN活性验证活性验证 Day1 小鼠3T3细胞铺板 Day3 药物筛选 puromycin 1 g ml Day6 收集剩余细胞 抽基因组DNA PCR靶向序列片段 扩增出500bp左右 Day2 Fugene 共转TALEN 左右臂质粒和EIP质粒 PCR产物测序结果 查看套峰 PCR产物进行TA克隆 测序 计算突变率 筛选出一对高活性的 TALEN质粒用于后续实验 目的基因片段目的基因片段PCR扩增扩增 Marker 560bp TALEN L TALEN R PCR F PCR R 200bp 200bp 在靶位点上下游设计在靶位点上下游设计PCR引物 对打靶后的细胞基因组引物 对打靶后的细胞基因组 DNA进行进行PCR 活性检测方法 活性检测方法 PCR产物测序产物测序结果查看峰图结果查看峰图 方法 TALEN质粒转染细胞 药物筛选 收集细胞提取基因组DNA PCR扩增 PCR产物测序 打靶效率中等的样品 活性检测方法 活性检测方法 PCR产物连产物连T载体 单克隆测序计算突变率载体 单克隆测序计算突变率 挑取30 50个克隆 将测序结果与目标基因的原始系列 进行比对 计算突变率 注 图中第一排WT为原始序列 表示缺失 红色为插入或置换 Step4 体外转录生成体外转录生成mRNA TALEN质粒线性化 mRNA浓度 纯度检测 根据载体所带启动子选择 相应试剂盒进行体外转录 原核启动子 sp6或T7 mRNA转录后的大小检测 若片段大于1 5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测 若片段较小 建议用聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测 Step5 胚胎注射胚胎注射mRNA TALEN左右臂 mRNA按1 1 比例混合 37 培养24h 至二细胞期 注射至一细胞 期受精卵 细胞质中 移至代孕雌鼠 中 至小鼠 出生 3周 注射浓度 300 500 ng ul 注射体积 5 15 pl Step6 F0代突变体小鼠检测代突变体小鼠检测 F0代小鼠剪尾 抽提基因组DNA T7E1酶切鉴定PCR 产物 进行初步筛选 PCR靶向基因序列 PCR产物连TA克隆 进行测序 进一步确认 F0代突变体小鼠 T7E1酶切鉴定法 剪小鼠的尾巴或脚趾 提取基因组DNA PCR扩增靶基因位点 PCR产物于94 失活 50 60 退火 T7E1酶37 作用1h 琼脂糖凝胶电泳检测 Step7 获得获得F1代杂合体小鼠代杂合体小鼠 F0代突变体小鼠 x 野生型小鼠 F1代杂合子小鼠 F1代小鼠剪尾 抽提基因组DNA PCR靶向基因序列 通过PCR产物测序 查看峰图及TA克隆 测序结果比对 鉴定F1代杂合体小鼠 同源重组介导的knockout animal model TALEN介导的knockout animal model 经由ES 同源重组打靶得到Knockout ES细胞系后 再注射到囊胚 无需经过ES阶段 直接注射到胚胎 进行打靶 打靶效率低 细胞内自然发生的同源染色体随机交换 打靶效率通常只有10 6至10 8 打靶效率高 TALEs特异性识别DNA碱基序列 Fok1切断双链DNA从而造成双链断裂 DSB 引入的DSB激活的DNA自我修 复引起基因的突变和促进靶位点DNA 同源重组 外源引发DNA断裂 几率 高 提高几百倍甚至千倍 同源臂很长 一般3 5 kb 克