转基因动物的检测方法.doc

转基因动物的检测方法转基因动物的检测方法 转基因技术是新兴的生物技术,具有广阔的应用前景,目前利用转基因技术获得的主要是粮食作物,其中转基因植物及产品已进入商品化生产阶段,转基因动物的研究尚处于实验室研究阶段,获得转基因动物技术难度较大,即使外源基因转进动物体内,检测也比较困难。这是由于如果整合拷贝数低,那么它的检测难度比单拷贝基因还大不表达,肯定也会增加检测难度,此外,当外源基因与内源性基因同源性很高时,检测也比较困难,因而选择适当的检测方法,避免造成疏漏及人力、;如果基因表达效率低甚至物力、财力的浪费是至关重要的。目前已有许多实验室结合分子生物学方法,探索出一些检测方法,下面从各不同检测水平来看转基因动物的检测方法。1 染色体和基因水平1.1 DNA 斑点杂交(DNA blot hybridization) 通过直接将变性的待测DNA 样品点在尼龙膜(或硝酸纤维素膜) 等固体支持物上,然后和探针杂交,从而检测样品中是否存在目的DNA 序列。根据点样方式和样品点的形状不同可分为斑点杂交、狭缝杂交( slot blot hybridization) 、打点杂交(spot blot hybridization) 。当目的基因与内源基因组DNA 无同源性时可用它,为避免假阴性,可同时用质粒DNA (1l0pg) 作阳性对照。该方法在分析基因组DNA 时,对样品纯度要求低、快速、简便、经济、灵敏度高(能从2g5g 的基因组DNA 中检出单拷贝基因),尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性,应作为首选方法。但该方法易出现假阳性。1.2 PCR(Polymerase chain reaction) PCR 技术是DNA 体外扩增技术,基本原理同体内DNA 的复制一样,均需经过DNA 模板解链、引物、结合及模板指导下的链延伸三个过程,在PCR 反应中是靠温度的调整和聚合酶的共同作用完成的。若PCR 体系中有一对方向相对的引物,通过反复重复变性、复性、延伸过程,则在短时内可将两引物间模板扩增至百万倍 。由于PCR 所需样品少,灵敏度高而且操作简便因而逐渐用于转基因动物外源基因整合、表达的检测。可极大提高转基因效率,减少人力物力的浪费。但该尤其在大型转基因动物研究中,用PCR 先对着床前的胚胎筛选,再将已证实携带外源基因的胚胎植入母体, 方法要求待分析的基因组DNA 样品应尽可能纯化,否则会干扰本反应,降低检测的灵敏度和重复性;此外用于大批量检测时,费用较昂贵。1.3 Southern 印迹法(Southern blot hybridization) Southern 印迹杂交技术是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜(或尼龙膜) 上的经酶切、电泳分离的变性DNA 链杂交,检测样品中是否存在目的DNA 序列的方法 。该法不仅灵敏而且准确,因而广泛用于转基因阳性鼠的筛选和鉴定。当转入基因与内源基因组DNA有较高同源性时,仍可用此法。,此法对样品的质量和纯度要求较高,操作烦琐,费用也较高。1.4 整合位点的检测染色体原位杂交(in situ hybridization) 染色体原位杂交是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段,其原理是利用碱基互补的原则,以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA 片段作探针, 与染色体标本上的基因组DNA 在“原位”进行杂交,经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察出目的DNA 片段在染色体上的位置 。最早同位素标记多采用放射性较低的3H 、35S 、及125I ,它们具有定位精确的优点,但放射自显影时间长而且操作较麻烦,随着荧光显微镜技术的发展,尤其是计算机图像处理系统的应用,增强了对荧光信号的分辨率,促进了非同位素在染色体原位杂交中的应用。1.5 整合拷贝数的检测外源基因的拷贝数通常以每个单倍体细胞中整合外源基因的分子数计算。测定拷贝数的方法有斑点杂交技术和Southern 印迹杂交等。其基本原理是在杂交实验中设置一系列阳性标准对照,然后将待测样品的结果(曝光或显色程度等) 和阳性对照比较,进而确定转基因整合的拷贝数。该杂交与普通的杂交不同,是一种定量杂交,需要高度纯化和已准确定量的基因组DNA 。一般点膜量为0. 5、1、2、4、8g 基因组DNA ,然后用1100pg 的梯度转基因片段为阳性对照和定量标准,最后计算出每个细胞中外源基因的拷贝数。一般说来基因水平检测,可选用Southern 印迹杂交(或在子代动物数量较少时,可直接选Southern 杂交) 结合斑点杂交和PCR 检测。若转基因与内源性基因同源性较小,且检测数量大,首先选斑点杂交进行粗筛,然后作Southern 印迹杂交,以便对完整的外源基因进行鉴定和确定其是否整合,再用染色体原位杂交和定量斑点杂交分别作整合位点和拷贝数的鉴定。若同源性较高时, 只要选用适当限制性内切酶酶切后也可用Southern 杂交分析。还可设计高特异性引物的PCR 法作外源基因是否整合的鉴定。2 转录水平在mRNA 水平检测外源基因是否表达,通常在作完整合检查, 并有足够子代动物数时进行。可采用Northern 印迹法、RT - PCR、引物延伸分析、RNase 保护分析,RNaseSl 保护分析法,其中最常用的为以下三种。2.1 Northern 印迹法(Northern blot hybridizathon)该方法是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜(或尼龙膜) 上的RNA 分子杂交,检测样品中是否存在目的RNA 序列。该技术操作简便,在转基因和内源基因同源性较小时,可用于转基因表达的检测。但是如果两者同源性较大,则方法受限,且操作步骤繁琐。2.2 逆转录- 聚合酶链式反应(RT - PCR)RT - PCR 技术基本原理是以总RNA 或mRNA 为模板,逆转录合成cDNA 的第一条链,经这条链为模板,在有一对特异引物存在的情况下进行PCR 检测转基因是否表达,还可进行定量。该方法可快速、精确地检测和定量分析半衰期较短和低丰富mRNA。同PCR 一样,该方法的不足在于重复性不好,难度大,费用更昂贵。2.3 RNase 保护分析在RNA 探针和靶RNA 分子杂交时,如果二者的同源性不同,则形成杂交体的结构不同:同源性100 % ,杂交体完全互补成双链分子;若同源性较低,杂交体因不完全互补将产生大小不同的单链环。因此,用RNase处理杂交体时完全互补的杂交体不被RNase 水解(被保护) ,而未杂交的单链和杂交体中的单链环则被水解。对探针分子而言,同源性不同的靶RNA 分子对探针的保护程度不同,电泳,自显影后,可得到不同长度的带型,故可以鉴定样品中RNA 分子。从原理上讲,当外源基因和RNA 和内源性RNA 只要有一个碱基的不同,即可通过RNase 保护分析将两者加以区分。由于该法具有高度的灵敏性, 且不受同源性的限制, 和Northern 法相比,本法更为准确,故被广泛应用于转基因转录水平的检测。但该方法操作步骤繁琐。上述方法中RT - PCR 和RNase 保护分析法最灵敏,核酸酶S1 保护分析次之,再者为引物延伸法,最后是Norhtern 印迹杂交。若转基因与内源基因同源性较小,可用Northern 印迹杂交;若同源性较大,则选用RT- PCR 或RNase 保护分析。3 翻译水平在蛋白质水平检测转基因是否表达包括两个方面,即转基因的mRNA 是否被翻译和被翻译的蛋白质是否有生物学功能。3.1 免疫检测技术采用涉及免疫学的一些方法,直接检测具有抗原性的蛋白质类表达产物的存在。3.1.1 免疫荧光抗体法检测表达蛋白此方法利用待检细胞株先后与第一抗体(被检蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体) 、第二抗体(葡萄球菌蛋白质A - FITC 或抗鼠Ig 标记荧光素) 反应,再用荧光显微镜观察照相。该方法简单易行,无需特殊仪器,无需进行蛋白质的提取,适用于蛋白质的定性研究。3.1.2 免疫沉淀法检测表达蛋白免疫沉淀法可用于检测并定量分析多种蛋白质混合物中的靶抗原。这种方法很敏感,可检测出100pg 的放射性标记蛋白。当与SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳并用时,即可用分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。3.1.3 Western 印迹分析(Western bloting) 检测表达蛋白质Western 印迹分析是20 世纪70 年代末80 年代初在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的,它结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点,与免疫沉淀法比较,这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。具有从混杂抗原中检测出特定抗原,或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性,还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析,具有蛋白质反应均一性,固相膜保存时间长等优点,因此该技术被广泛用于蛋白质研究,基础医学和临床医学研究。3.1.4 免疫酶标法(ELISA 分析)该方法由Engrall 和Perlmann 于1977 年创立,以酶作为标记物或指示剂,进行抗原或抗体的检测。该方法特异、敏感,与放射免疫法比较,具有所需仪器设备简单、试剂价廉、无放射性危害等优点。ELISA 方法中所用的酶有辣根过氧化物酶(HRP) 、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等。由于HRP 活性强、价廉、性质稳定,故在ELISA 中使用最广。目前我国复旦遗传所创新地使用了双抗体夹心ELISA 法,并检测了转基因细胞中的人凝血因子IX。一般来说,Western 印迹法更适用于少量样品的定性检测,而ELISA 方法可一次方便检出几十甚至几百个样品。3.2 生物化学性质和生物学活性分析除直接测定基因表达产物外,还可通过定性或定量测定表达产