通心络胶囊干预载脂蛋白E基因敲除小鼠冠状动脉粥样硬化形成机理的.doc

通心络胶囊干预载脂蛋白E基因敲除小鼠MMP-1、MMP-9及TIMP1的研究Study of Tongxinluo Capsule in Intervention of Apolipoprotein E Gene Knocking Out MMP-1, MMP-9 and TIMP1 in Mice 韩 旭 李七一 夏卫军 赖仁胜 陈小虎 郭宏敏 赵 惠Han Xu, Li Qiyi, Xia Weijun, Lai Rensheng, Chen Xiaohu, Guo Hongmin, Zhao Hui江苏省中医院（中国 210029）Traditional Chinese Medicine Hospital in Jiangsu Province ( China, 210029)中图分类号：R285.6 文献标识码：A 文章编号：18180086（2010）04摘 要：目的 通过通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除ApoE（-/-）模型组小鼠基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）水平等指标的干预变化，探究其治疗冠心病（CHD）的机理。方法 将40只ApoE （-/-）小鼠作为实验组，建立冠状动脉粥样硬化（AS）模型，随机分为模型组等5组，分别给予辛伐他汀及不同剂量的通心络胶囊进行干预，另选8只同系的小鼠作为正常对照组。通过对模型组小鼠血清MMP-1、MMP-9 和TIMP1水平的观察，比较分析通心络胶囊对ApoE （-/-）小鼠冠状AS的调节作用并探讨其机理。结果通心络胶囊高剂量组小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有统计学意义（P0.05或P0.01）。通心络胶囊中剂量组小鼠血清MMP-9水平低于模型组，与模型组相比有统计学意义（P0.05）。结论通心络胶囊具有抑制血管重构和稳定斑块的作用。关键词：通心络胶囊；ApoE（-/-）小鼠；冠状AS；MMP-1；MMP-9；TIMP1；干预Abstract Objectives To investigate mechanism of Tongxinluo Capsule managing coronary heart disease (CHD) by observing changes resulting from intervention of apolipoprotein E gene knocking out ApoE (-/-) MMP-1, MMP-9 and TIMP1 in mice model. Method 40 ApoE (-/-) mice, as experimental group, were used to establish coronary arteriosclerosis (AS) model and then were randomly divided into 5 model groups. Simvastatin and Tongxinluo Capsule at different dosage were administrated to mice respectively as intervention and 8 mice of same kind were selected as control group. Tongxinluo Capsules effect in regulating coronary AS in ApoE (-/-) mice and its mechanism were compared and analysed during the experiment by observing serum MMP-1,MMP-9 and TIMP1 levels in model mice. Results in group administrated high dose Tongxinluo Capsule, serum MMP-1 and MMP-9 level were lower than that in model group without intervention, but TIMP1 was higher. The difference is significant statistically (P0.05 or P0.01). In the group administrated moderate dosage Tongxinluo Capsule, the serum MMP-9 was lower than that in model group without intervention, which also has statistical significance (P0.05). Conclusion Tongxinluo Capsule is of some effect in the inhibition of vascular remodeling and stabilization of plaques.Key words Tongxinluo Capsule, ApoE (-/-) mice, coronary AS, MMP-1, MMP-9, TIMP1, intervention 1 实验材料1.1 药品与试剂通心络胶囊：石家庄以岭药业股份有限公司生产，规格：每粒0.38克。批号：20060501。MMP-1、MMP-9、TIMP1测定试剂盒，购自晶美生物工程有限公司，美国Oriono Diagostica公司生产，批号：00604。 胆固醇，上海生化试剂厂，批号：051124。1.2 实验动物ApoE（-/-）小鼠，40只，鼠龄8周龄，雌雄各半，体重18-22g。（品系C57BL/6J，购自美国Jackson实验室）由北京大学实验动物中心提供。同遗传背景C57BL/6J小鼠8只，鼠龄8周龄，雌雄各半，体重18-22g。动物生产许可证号： SCXK（京） 2002-0001。南京中医药大学实验中心，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2002-0123。1.3 实验仪器SYSMAX全自动生化分析仪 日本SYSMEX公司TGL16G台式高速离心机 上海医用分析仪器厂UN754分光光度计 上海第三分析仪器厂JA2003分析天平 上海天平仪器厂AUP-2-35G-01 实验室级专用超纯化水机 重庆颐洋实业有限公司DKZ2型电热恒温振荡水槽上海精宏实验设备有限公司LDZ52低速自动平衡离心机 北京医用离心机厂LRB-12752计数器 芬兰 1.4 实验条件小鼠单笼饲养，自由饮水，室温202。2 实验方法2.1 高脂饲料配制方法以5%胆固醇，10%猪油，0.1%丙基硫氧嘧啶，加入小鼠标准饲料粉中。饲料粉经充分混合后由江苏省青龙山动物养殖场加工成颗粒饲料。2.2 ApoE（-/-）小鼠冠状动脉粥样硬化建立ApoE（-/-）小鼠适应性喂养一周后给予高脂饲料，连续喂养12周。同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J小鼠8只，雌雄各半作为正常对照组，2.3 给药方法和剂量2.3.1 正常对照组 喂普通颗粒小鼠饲料，同时给予等量蒸馏水。2.3.2 模型组：喂高脂饲料，同时给予等量蒸馏水。2.3.3 通心络胶囊1组 除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊2g（生药）/kg体重。2.3.4 通心络胶囊2组 除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊4g（生药）/kg体重。2.3.5 通心络胶囊3组 除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊8g（生药）/kg体重。2.3.6 辛伐他汀组 除与模型对照组相同外，给予辛伐他汀0.05g/kg体重。2.4血清MMP-1、MMP-9、TIMP1 浓度水平测定采用定量夹心酶免疫分析技术。3 统计分析方法描述性统计分析，定性指标以频数表，百分率或构成比描述；定量指标以均数，标准差描述。两组对比分析，定性资料采用卡方检验，Fisher精确概率法，Wilcoxon秩和检验，CMH c2检验。定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验），不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验，Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验，给出检验统计量及其对应的P值。以P0.05作为有统计学意义，以P0.01作为有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。4 实验结果从表1中可见，ApoE（-/-）小鼠造模后12周，模型组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平显著升高，而TIMP1水平显著降低，与正常组相比，均有统计学意义（P0.05或P0.01）。通心络胶囊高剂量组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有统计学意义（P0.05或P0.01）。通心络胶囊中剂量组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9水平低于模型组，与模型组相比，有统计学意义（P0.05）。表1 通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1、MMP-9及TIMP1水平的影响（g/L，XS）分 组剂量（g/Kg）动物数（n）MMP-1MMP-9TIMP1正常组8290.8815.36482.6347.65 157.8821.56模型组-8 330.6338.33 805.63120.14 63.3811.76低剂量组28308.8850.30656.6383.23*70.2522.63中剂量组48312.1338.68666.88137.89* 87.2530.41高剂量组88 283.6338.64*648.88112.15* 93.8825.48*辛伐他汀组0.058 293.7528.71* 568.50104.49* 88.7524.59*注：与正常组相比，P0.01，P0.05；与模型组比较，* P0.05，* P0.01。5讨论AS的形成涉及脂质代谢紊乱、血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖等。大量研究已证实，细胞外基质（ECM）合成或降解失衡是AS形成过程中十分重要的环节，AS形成过程也是ECM重建即血管重构的过程2。基质金属蛋白酶（MMPs）是一族可降解ECM胶原的重要蛋白酶类，在AS发生期可促进VSMC向内皮的移位，其在分解冠脉粥样斑块纤维帽ECM，使纤维帽变薄、易于破裂方面起着重要作用3。研究发现，粥样斑块组织中，尤其是纤维斑块的肩部可检出大量巨噬细胞及多种MMPs。在泡沫化过程中多种细胞因子调节其他细胞分泌大量MMPs进一步降解ECM，促使脂质条纹的形成并加速粥样斑块的发展4。MMP-1是MMPs家族重要的一员，主要降解间质胶原、X型胶原和蛋白聚糖的核心蛋白。研究表明MMP-1的表达及活性增强与CHD的发生、发展密切相关5。Nikkari等6报道人类AS斑块脂质核心强烈表达MMP-1，通过降解型和型胶原蛋白，使纤维帽变薄，促进粥样斑块进入不稳定状态。另外，原位酶谱实验证明人的粥样斑块，尤其是机械张力最高之处，MMP-1表达增加7倍，而该处又是斑块破裂常见之处，据此推测，在这些部位基质降解过度同时又有机械张力过度而使纤维帽破裂7。MMP-9是MMPs家族中明胶酶的一种，研究表明8，MMP-9与AS关系密切，可以高效降解基底膜的主要成分IV型胶原。Brown等9报道MMP-9通常在新近斑块破裂的冠状动脉旋切标本中表达。Peterson等10研究发现MMP-9含量在不稳定心绞痛病人斑块组织中明显高于稳定型心绞痛病人，MMP-9的过表达，可使ECM降解活性增强，从而降低斑块强度，促使斑块破裂。冠状动脉内径狭窄程度也与MMP-9呈正相关。TIMP1为MMPs的组织抑制剂11，Inokubo等12.13.14认为正常内皮细胞和平滑肌细胞有TIMP1和MMP9的表达，且两者处于平衡状态，以共同维持ECM合成与降解相对平衡，使斑块趋向稳定，不易破裂。MMP-9升高、TIMP1的降低预示着硬化斑块的不稳定或破裂。在急性冠状动脉综合征的发生过程中，MMP-9表达增加大于TIMP1表达增加，使冠状AS斑块纤维帽的胶原降解大于合成，导致斑块脆性增加并最终破裂15。George16研究证实用TIMP1或调节其与MMP-9之间的比例可起到治疗AS的作用。我们既往研究提示：通心络胶囊具有抑制ApoE (-/-)小鼠冠状AS的作用17，本实验结果表明该药还能通过抑制MMP-1、MMP-9和升高TIMP1血中浓度而具有抑制血管重构和稳定斑块作用，且其强度与药量的大小有关，推测其机制可能为：抑制VSMC的增殖和移行，调节ECM的合成和降解，稳定斑块纤维帽。参考文献：1 JnaLBreslwoMouse models of atheroselerosisJSeinece1996，V0L272：685-6882 温进坤,韩美.基质金属蛋白酶与血管壁细胞外基质重建J.生命的化学,2002;22(5):461-463.3 Shah PK,Falk E, Badimon J J,etal. 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