金属离子对纤维酶活性的影响.doc

齐齐哈尔大学课程实验论文课程实验论文 学院：食品与生物工程学院 专业：生物工程 班级：082班 姓名：赵性林 学号：2008053057金属离子对纤维酶活性的影响摘要：研究了多种金属离子对放线菌纤溶酶活性的影响。通过研究金属离子对纤溶酶活性的影响，探讨金属离子对纤溶酶活性影响的作用机理。关键词：金属离子 纤溶酶 活性1前言1.1纤溶酶概述纤溶酶可来源于人体、动物和微生物等。其中以微生物产酶的来源最广泛。除早期发现的溶血链球菌产链激酶和金黄色葡萄球产葡激酶外,又陆续发现一些菌株产纤溶活性物质。主要有来自芽孢杆菌的纤溶酶、来自芽孢杆菌的纤溶酶及其它微生物来源的纤溶酶。随着生物技术不断发展, 近年来又有学者陆续从海洋假单胞杆菌、根霉中筛选到了新型的具有纤溶活性的物质,并对其中的某些活性成分进行了分离提纯, 对性质、药理和药效进行了研究。我国的刘晨光等13从一株洋溢假单胸杆菌中分离纯化出一种具有纤溶活性的酶, 分子量为21kDa, 等电点为7. 4 7. 5, 最适温度为50。该酶能够切割Arg 或Lys 形成的肽键。但是对该酶结构、催化特征以及毒理、药效作用等研究还未见报道。在国内现有的相关研究主要集中在纤溶酶产生菌种的筛选、发酵条件的优化等方面。对于豆豉纤溶酶的分离纯化及酶学性质的研究非常有限，对其核苷酸和氨基酸分子水平的研究更为鲜见。目前我国研究人员从豆豉中分离得到了一种高活性的纤溶蛋白酶，它有较强的溶血栓能力、不溶解正常血细胞、无毒副作用以及在体内的半衰期较长等特性。其次由于该酶具有分子量小可通过消化道直接吸收由此可开发为口服药;再则该酶可通过大量发酵生产造价低的优点因此在心脑血管疾病的防治上有着良好的应用前景。国外的研究领域在研究中发现：纤溶酶能将纤维蛋白（原）-链和-链P1位点的疏水性氨基酸进行特异性的酶切，从而产生与体内纤溶酶相似的酶切片段，其次纤溶酶还能通过酶切纤溶酶原激活抑制剂及使之处于无活性状态等作用进行血栓溶解。1.2 本文的主要研究目的本文是对金属离子对纤溶酶活性进行研究。为了解纤溶酶的性质为临床提供一些理论依据。2实验方法及材料2.1 主要试剂仪器放线菌纤溶酶、各种盐试剂ZnSO47H2O CuSO45H2O NaCl KCl CaCl2 CoCl26H2O MgSO47H2O MnCl24H2O FeCl24H2O 血纤维蛋白平板、离心管、小烧杯、容量瓶、双蒸水等。2.2 实验方法与步骤 分别配置各种离子溶液1ul/mol、2ul/mol、5ul/mol、10ul/mol、100ul/mol，取放线菌纤溶酶20ul和各种离子溶液及不同浓度溶液20ul混合至离心管中，等体积混合。另配置水和纤溶酶的对照用液。全部置于37C恒温18个小时候后取出，各取10ul滴血纤维蛋白平板，恒温培养6个小时后测酶的活力。2.21纤溶酶的分离纯化粗酶液经离心除杂后，进行30%-60%硫酸铵分级盐析，盐析所得样品经Octyl Sepharose 4 Fast Flow疏水相互作用层析分离，使用含30%饱和度硫酸铵PBS缓冲液pH值7.4为进行梯洗，Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用层析分离得到纤溶酶活性组分。采用纤维蛋白平板法测放线菌菌株发酵液的产纤溶酶活力，发现该株放线菌具有较强的产纤溶酶能力。2.22血纤维蛋白平板制备取0.125g琼脂糖加入27mL生理盐水中，加热溶解后置45水浴中保温30min后，加入500U/mL的凝血酶250L，混匀。取1支80mg/支血纤维蛋白原溶于27mLHCl-巴比妥钠缓冲液(pH7.8)中，置45水浴中保温5min。分别取5mL凝血酶溶液与5mL血纤维蛋白原溶液混合均匀后，快速倒入9cm平皿中，混匀，水平放置30min后置冰箱中备用。2.23酶活力的测定取恒温培养后的血纤维蛋白平板，用游标卡尺分别测出溶圈直径。相对活力=各浓度离子溶液的溶圈直径的平方/无离子溶液形成的溶圈直径的平方。3 结果与讨论3.1测得数据如下离子 离子浓度 离子溶液 酶的加入量 溶液中的 溶圈直径 相对活力 （mM） 的加入量 （ul） 离子浓度 （cm） （%） 1 0.5 0.643 119.18 2 1.0 0.513 75.85 Cu2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.457 60.20 10 5.0 0.403 46.81 100 50.0 0.000 0.000 1 0.5 0.514 76.15 2 1.0 0.507 74.09 Fe2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.431 53.55 10 5.0 0.287 23.74 100 50.0 0.302 26.29 1 0.5 0.531 81.28 2 1.0 0.713 146.54 Zn2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.721 149.84 10 5.0 0.303 26.46 100 50.0 0.000 0.000 1 0.5 0.571 93.98 2 1.0 0.653 122.91 Co2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.591 100.68 10 5.0 0.536 82.81 100 50.0 0.273 21.48 1 0.5 0.493 70.06 2 1.0 0.406 47.51 K+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.416 49.88 10 5.0 0.403 46.81 100 50.0 0.401 46.35 1 0.5 0.491 69.49 2 1.0 0.496 70.91 Ca2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.453 59.15 10 5.0 0.493 70.06 100 50.0 0.504 73.22 1 0.5 0.413 49.17 2 1.0 0.463 61.79 Mg2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.417 50.12 10 5.0 0.457 60.20 100 50.0 0.504 73.22 1 0.5 0.427 52.56 2 1.0 0.403 46.81 Mn2+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.416 49.88 10 5.0 0.422 51.33 100 50.0 0.345 34.31 1 0.5 0.478 65.86 2 1.0 0.532 81.58 Na+ 5 20 ul 20 ul 2.5 0.479 66.14 10 5.0 0.512 75.56 100 50.0 0.467 62.86 水. 0.589 100.003.2 结果分析 金属离子Mn2+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+对酶活性有一定抑制作用，Cu2+、Zn2+离子在一定浓度下对酶活有促进作用，Cu2+、Fe2+、Zn2+、Co2+在高浓度对酶活性有很大抑制作用，Mn2+总体对酶活性抑制很大。3.3 原理探究 近三分之一已知酶的活性需要金属离子的存在，这些酶分为两类，一类为金属酶，另一类为金属激活酶。前者含有紧密结合的金属离子，多数为过渡金属，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co2+，后者与溶液中的金属离子松散地结合，通常是碱金属或碱土金属，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+。金属离子参与的催化被称为金属催化。金属离子以5种方式参与催化：（1）作为Lewis酸起作用；（2）与底物结合，促进底物在反应中正确定向；（3）作为亲电催化剂，稳定过渡态中间物上的电荷；（4）通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与氧化还原反应；（5）酶结构的一部分。纤溶酶和金属离子可产生底物形变，底物形变是指当酶与底物相遇时，酶分子诱导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子张力”发生形变，比较接近它