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化学合成的Oligo用于克隆须知（赛百盛）不管化学合成的Oligo DNA为短片段还是长片段，只要用于PCR克隆，最好对Oligo DNA粗制品进行纯化。尽管如此，客户还是须考虑如下风险： 1. 内部缺失（n-1，n-2 etc）产物。这是化学合成DNA最普遍与最主要的限制因素，且不能通过纯化Oligo DNA来解决这个问题。化学合成DNA不及活细胞内DNA复制具有高保真性，在活细胞内，存在大量的校正与修复系统，将碱基突变率降低至 1/(1106)甚至1/(1109)以下。PCR反应也具有较高的保真度，例如：错误率在1/1000或1/10000。 PCR反应可通过DNA聚合酶的性能提高保真度。但 是化学合成DNA与活细胞及PCR反应扩增DNA不 同，每次合成循环的错误率约为1/100，主要包括以下几方面的因素。(1) Oligo DNA的化学合成是碱基与碱基之间通过化学反应偶联而成，而化学反应的偶联效率一般在99%左右，也就是说，在每次进行偶联反应时，都会有1%的DNA片段附加不上新的碱基，对这种截断的失败序列，为了防止其参与后续的偶联反应，采用CapA与CapB进行化学封闭，以阻断其延伸，但化学封闭反应的效率不可能达到100%。导致出现合成失败的DNA片段或截断序列残留在合成的DNA粗制品中。(2) Oligo DNA的不完全脱保护。寡核苷酸的完全脱保护包括从磷酸酯基团、碱基上的环外氨基和5-OH部分上去掉保护基团。脱保护的化学反应效率不可能达到100%，未脱保护的碱基无法参加偶联反应而导致oligo DNA内部缺失碱基。(3) 不断延长的DNA链与不断减少的合成试剂会干扰oligo DNA的化学合成。对于以上三方面问题，至今为止还没有找到一个完美的试剂给予解决。因为延长盖帽时间也不能保证封闭反应效率达到100%；而对于脱保护反应来说，增加脱保护试剂量及延长脱保护时间又会导致oligo DNA脱嘌呤。因此只能采取折衷方法将不完全脱保护与脱嘌呤同时控制在低水平上。内部缺失碱基的截断序列绝不可能100%去除干净，对于几种纯化方法来说，OPC或HPLC不可能去除内部缺失碱基的截断序列，最好的方法是通过PAGE纯化降低截断序列数量。OPC与HPLC纯化法是通过两种不同形式的柱层析方法对oligo DNA进行纯化，PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化，但都不易将缺失一个碱基（n-1）或两个碱基（n-2）的oligo DNA与全长oligo DNA分离。柱层析与PAGE对于分析检测少量的oligo DNA是一种合适的手段，但作为纯化制备目的DNA片段，并不是非常有效。因此，在合成的目的oligo DNA中，总会存在少量的截断序列。由于这些错误的随机性（不同分子有不 同的碱基突变，同时多数分子没有碱基突变），这种序列的错误率通常对普通PCR、测序或杂交不会存在问题，对于合成不太长的序列，更是如此。然而，克隆过程是单个oligo DNA分子的选择与扩增过程，若单个亲本分子存在序列错误，那么单克隆中所有分子都存在相同的序列错误。2. 单核苷酸的插入是存在于目的oligo DNA产物中的另一种常见的序列错误。 当同一oligo DNA分子中存在G-偶联或单碱基插入（n+1）同时又存在单碱基缺失（n-1）时，此条oligo DNA的长度与目的DNA分子的长度相同，因此无法通过OPC、HPLC或PAGE纯化将此“失 败序列”去除。3. OPC、HPLC特别是PAGE是产率损耗很大的纯化方法，因此会导致低产量（OPC与HPLC的 得率约为30%50%，PAGE的得率约为10%30%），主要的原因是大量的目的oligo DNA分子（全长与 正确的Oligo DNA）在纯化过程中会随着失败序列一起被去除。Oligo DNA 化学合成存在的这些弊端曾被Hecker KH与Rill R报道过（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides. Biotechniques, 1998 Feb; 24: 256-260）。在这篇文章中，作者合成并 PAGE纯化了长链oligo DNA，用它们进行PCR克隆，然后测序鉴定了10个克隆，发现存在7个单碱基缺失，一个连续的4个碱基缺失，一个G-C替换。除了这些碱基错误，其它学者还曾报道存在G-偶联、分支及其n+x产物。解决这些碱基出错的方法： （1）对oligo DNA 粗制品进行纯化。不仅要通过OPC、HPLC、PAGE等方法对Oligo DNA进行纯化，而且需要优化化学合成方法来提高Oligo DNA的纯度。（2）当OPC、 PAGE或HPLC纯化的Oligo DNA用于PCR克隆时，可能会存在一些序列错误的“突变”克隆（这些碱基错误的克隆可能源于Oligo DNA的合成）。因此，我们建议客户多挑几个克隆（而不仅仅是一个或两个克隆），一般情况下会挑到正确的克隆。（3）减少转化后预温育时间（未加抗生素）。因为在未加抗生素情况下，延长温育时间可能会导致单个突变克隆的扩增。（4）挑克隆时，应挑选分隔良好、新鲜的、不太大的单菌落。（5）若可能，尽量使用较短的 Oligo DNA，而避免合成长链Oligo DNA。 客户不要因上面的警告而感到合成Oligo DNA出错的风险无法避免。其实，挑到正确克隆的可能性很大，特别是对Oligo DNA进行纯化后，情况更是如此。如果测序后发现Oligo DNA出现错误，公司免费重新合成。上面所提出的建议仅仅是帮助客户理解目前Oligo DNA化学合成所存在的问题，对客户订购与使用Oligo DNA时提供一些帮助。常见问题及参考意见（赛百盛）Q：Oligo DNA制品的形态? A：Oligo DNA制品呈现白色粉末或无色透明均为正常形态。我公司提供的Oligo DNA制品为白色粉末或絮状物，一方面客户能肉眼观察到白色制品，另一方面保证Oligo DNA能即刻溶解。 但由于Oligo DNA制品受空气中水份的影响，制品被潮解而吸附于离心管壁或管盖上，呈现无色透明状或难以观察到，遇到这种情况时请在使用前先离心收集Oligo DNA制品于管底，然后溶解Oligo DNA制品。 Q：如何稀释Oligo DNA制品? A：收到Oligo DNA后，首先请短暂离心，收集Oligo DNA制品于管底，然后慢慢打开管盖，加适量的无菌超纯水或TE缓冲液，盖上管盖，充分上下振荡或用手指弹管底，使Oligo DNA充分溶解。相关的说明及数据请参照我公司的DNA合成报告单。下面举例说明：例：您得到一管标为5 OD260的20mer Oligo DNA： TGG GCG GCG GTT GGT GTT AC A=1 C=3 G=10 T=6 MW=(1312)+(3288)+(10328)+(6303)-61=6213 关于分子量，您也可以采用平均分子量的近似算法：MW=20324.5=6490质量数=533=165g摩尔数=165/6490=0.025mol=25nmol若加入250l超纯水溶解，则浓度为：25nmol/250l=100M=100pmol/lQ：怎样制备100mM的储备液?A：体积（l）=DNA合成报告单上的nmol数目10Q：Oligo DNA制品如何保存?A：（1）Oligo DNA干燥制品很稳定，常温下可保存数月，但最好置于-20保存。（2）溶解后的DNA溶液可于4短期保存，长期保存请置于-20。在溶解和使用DNA溶液时，请避免核酸酶污染，减少DNA溶液的反复冻融。（3）荧光标记Oligo DNA对光敏感，在日光下荧光强度会降低。为了保持荧光标记Oligo DNA 的荧光效率，请于-20避光保存。 Cy3与Cy5在溶液pH9的条件下会发生分解，所以稀释Cy3与Cy5标记的Oligo DNA 时请注意溶液的pH值。 Q：Oligo DNA制品在常温下放置了一周还能正常工作吗？A：Oligo DNA的干燥制品是非常稳定的，即便在溶液中也很稳定。一般情况下，只要没有核酸酶、细菌等的污染，Oligo DNA制品于常温下放置一周仍然能够正常工作，但长期保存请最好置于-20。 Q：Oligo DNA 制品可以用琼脂糖凝胶电泳检测吗？A：由于化学合成的寡核苷酸所具有的特性，不能使用Agarose Gel及EB染色方法进行质量和浓度检测，必要时请使用变性PAGE电泳检测。主要原因如下：（1）Oligos是单链DNA，容易形成立体结构。跑琼脂糖凝胶电泳时，容易出现多条带。（2）Oligos为单链，而EB染色是嵌入到DNA 双链的碱基之间。因此，单链DNA形成的立体结构越复杂，EB染色就越容易，DNA 条带就越亮。如果单链DNA不形成立体结构，EB就无法染色。Q：长度相同、碱基组成不同的Oligo DNA进行变性PAGE电泳时，电泳带应该在同一位置吗？A：对于短链DNA来说，会有差异，但长链DNA 差别很小，主要原因如下：（1）A、G、T、C组成不同，电泳速度不同。（2）DNA立体结构不同，电泳速度不同。Q：含有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸可以合成吗？A：我公司成功的合成过含有连续15个鸟嘌呤以上的寡核苷酸。高嘌呤含量的寡核苷酸，特别是含有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸，有发生聚集的倾向而形成guanine tetraplex，纯化时需要较强的变性条件，而变性剂往往会危害到寡核苷酸的具体应用。通过Inosine替换其中的一些鸟嘌呤，可一定程度降低guanine tetraplex的形成。 Q：如何制备双链DNA?A：（1）用退火缓冲液（10mM Tris pH8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA）溶解单链DNA，浓度为15OD/100l。（2）将两条互补单链等摩尔数混合。（3）94温浴25分钟，然后缓缓冷却到室温（25以下）。（4）4保存备用。Q：普通合成的Oligo DNA 5末端带磷酸基团吗？A：不带磷酸基团。Oligo DNA的5末端和3末端均为-OH基。如果合成Oligo DNA时需要带磷酸基团，请特别注明，同时我公司需收取磷酸化修饰费用。 Q：常用简并Oligo DNA（混合碱基）的代码：A：M=（A/C），W=（A/T），H=（A/T/C），V=（G/ A/C），D=（G/A/T），Y=（C/T），K=（G/T）， S=（G/C），B=（G/T/C），N=（A/G/C/T），R= （A/G）。 Q：简并性Oligo DNA对PCR扩增的影响?A：通常一条Oligo DNA中简并的碱基不要超过4 处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效Oligo DNA的量相对减少，此时应适当增加Oligo DNA的使用量。但Oligo DNA量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。 Q：合成的Oligo DNA多次PCR无目的产物。A：如果PCR后无目的产物，可以从以下几方面寻找原因：（1）Oligo DNA设计是否合理。（2）Oligo DNA和模板是否配对或同源性有多大。（3）PCR反应试剂是否存在问题：模板DNA、DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Oligo DNA等。（4）PCR仪是否正常工作。（5）退火温度及其它反应条体是否优化。（6）模板是否存在复杂结构：GC含量高、重复序列等。影响PCR失败的因素很多，可从多方面分析考虑，若仍然扩增不出带，可要求我公司重新合成Oligo DNA，以排除合成因素的影响。 Q：进行反义DNA（antisense DNA）实验时，对DNA 链是采取点硫代还是全程硫代修饰？A：进行硫代磷酸酯寡核苷酸合成时，寡核苷酸间非桥键的等价氧之一被硫所取代，形成了一个手性硫代磷酸二酯，一种体内核酸酶代谢的拮抗剂。特定的片段使特定基因表达中的mRNA 转录无效，这种现象被称为“反义效应”。为了取得最好的保护效果，许多学者将整条链进行硫代修饰，但这样会使碱基的配对效率降低。因此，通常将片段的两端进行硫代修饰，这样也可取得良好的保护效果，同时又可避免中央片段配对效率的降低。但具体的实验方案须根据您的实验目的及要求决定。 Q：PCR产物经克隆后测序发现Oligo DNA处碱基有误，为什么？A：（1）PCR过程的错配：DNA聚合酶忠实性低、循环数太多、四种dNTP的浓度不同都可能导致在PCR产物序列中Oligo DNA错误。 （2）克隆过程中引起的突变。 （3）测序导致的错误。 （4）合成仪管路的瞬时阻堵，结果引起单个碱基或一部分碱基缺失。 （5）计算机程序失灵导致错误合成。 （6）碱基在偶联到DNA片段之前，碱基与碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，导致多碱基现象。 （7）合成过程中出现脱嘌呤，对脱嘌呤后的碱基，DNA聚合酶不能识别，可能导致PCR 后出现A或G缺失。 （8）脱保护不完全导致碱基缺失。 （9）Capping反应不完全，截断DNA（n-1）继续参与后续合成，导致缺失碱基。出现以上情况的概率极低，您可以通过多挑几个克隆得到解决；您也可以通过点突变的方式予以纠正。如果这两种方式您不愿意做，我们公司可以提供免费合成一次。Q：能保证合成的Oligo DNA 100%正确吗？A：不能。Oligo DNA的合成是化学反应的过程，由于化学反应的特性，Oligo DNA的纯度不可能是100%，因此多测几个克隆，也许会挑到正确的克隆。 Q：怎样保证合成Oligo DNA的高正确率？A：（1）选用高纯度Oligo DNA。（2）选用小于35mer的Oligo DNA。（3）进行克隆实验时需进行测序验证，尤其进行蛋白表达实验时更须如此。 Q：PCR产物可以直接克隆吗？A：PCR用Oligo DNA的5端为-OH，因此扩增后的PCR产物5端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。建议对PCR用Oligo DNA的5端进行磷酸化修饰或对PCR产物的5端进行磷酸化处理。 Q：琼脂糖凝胶分析PCR产物时观察到非特异条带为什么？可能原因建议解决方法形成引物二聚体 设计在3端没有互补序列的引物。引物与模板非特异性退火 1、以2间隔增加退火温度，减少退火时间。 2、在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。3、采用Hot start法或Cool start法。镁离子浓度太高 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。污染外源DNA 在PCR过程中使用良好的实验步骤减少污染源。因为二级结构导致引物结合位点无法接近 对于GC%50%模板，使用改善模板GC含量的优化剂。引物设计不合理 1、改变引物的位置，增强特异性。2、增加引物长度，增强特异性。模板DNA量过多模板DNA量20%递减。25. PCR扩增不出来，跟引物有关吗？基本上不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段、GC含量高的片段扩增，必须采用特殊扩增手段才能扩增出来。 扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：1) RT-PCR。很多基因通过常规RT-PCR方法是很难扩增出来的。RT- PCR成功的关键在于RT反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中的含量。2) 从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg2+浓度和pH。 26. 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办? PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑：1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?2) 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构?3) PCR反应用试剂是否能正常工作?4) PCR仪是否工作正常?5) PCR反应条件是否合适? 如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物一次。 27. PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？不能。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。因此非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。28. 如何将两条互补的单链退火形成双链？ 用退火缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5-8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500 l，加热到95 2 min，然后缓慢冷却至室温（低于30 ）即可。退火的产物可以放在4 待用。29. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。siRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。34. 常见的引物修饰的有哪些?修饰 说明 磷酸化（Phosphorylation）5磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。3磷酸化可抗3外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。 生物素（Biotin）引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。 地高新（Digoxigenin）地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southern blotting）、DNA-RNA杂交（Northern blotting）、斑点杂交（Dot blotting）、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析（ELISA）。 内部氨基修饰主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶），目前提供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin 修饰。 5氨基修饰可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重标记诊断系统。目前提供5 C6 氨基修饰和5 C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。 3氨基修饰目前提供3 C6 氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3修饰可以抑制3外切酶酶解，从而可用于反义实验。 巯基（Thiol）5-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5的巯基修饰主要用5巯基修饰单体（5-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。用5-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。 间臂（Spacer）Spacer 可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer 主要用于模仿核糖的3和5羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3-Spacer C3用于引进一个3间臂从而阻止3端外切酶和3端聚合酶发挥作用。 Spacer 18 常用于引进一个强疏水基团。 硫代（Phosphorthioate）硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5和3各3个碱基进行硫代修饰。 脱氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 。 脱氧次黄嘌呤（deoxyInosine，dI）脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基，但当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC dI:dA dI:dG dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合36. 合成的荧光标记探针应如何保存? 荧光探针保存方法如下：1) 荧光探针必须避光保存。2) 干品可于-80保存一年以上,如无条件，请于-20保存。3) 强烈建议用RNase-free的TE (pH 8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成100 pmol/l的储备液，分装成几份 (每份最多反复冻融5次)，于-20 保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/l或20 pmol/l)，剩余部分于-20 保存。 37. 常见的荧光染料有哪些？荧光染料参数缩写 全名 吸收波长 发射波长 颜色 6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494 nm 518 nm Green TET 5-tetrachloro-fluorescein 521 nm 538 nm Orange HEX 5-hexachloro-fluorescein 535 nm 553 nm Pink TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560 nm 582 nm Rose ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587 nm 607 nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552 nm 570 nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643 nm 667 nm Violet 38. 5-FAM、6-FAM、FITC标记之间有何区别? 5-FAM、6-FAM、FITC标记都是荧光素标记 (Fluorescein)，5-FAM与6-FAM互为异构体；而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前两者(酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。39. 淬灭基团为TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同? 由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称TaqMan探针，用于实时荧光定量PCR实验。1) TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，会在更高波长处发射荧光。而Eclips