益生菌菌株的筛选及应用中应注意的几个问题[会议论文].pdf

全国功能性生物制品生产与应用技术交流展示会论文集蒹骤茎辩慧 篇羹鬻 益生菌菌株的筛选及应用中应注意的几个问题 广州番禺梅山一马利酵母有限公司 杨晓斌谢拥葵韦燕鹏 摘要 益生茵克服了非营养性添加剂特别是抗生素带来的负面效应 它是无污染 无残留 抗疾病 促进动物生长的天然添加剂 在饲料工业中得到了广泛的应用 结合笔者的研究 本文着重介绍了益生 菌菌株在筛选和应用过程中应注意的几个问题 关键词 益生菌筛选问题 益生菌作为微生态制剂的一大类 克服了非 营养性添加剂特别是抗生素带来的负面效应 它 是无污染 无残留 抗疾病 促进动物生长的天 然添加剂 在饲料工业中得到了广泛的应用 其 作用机理主要表现在 争夺动物肠道的氧气 造 就大量有益菌的生存环境 维持动物肠道的菌体 平衡 产生有益代谢产物杀死或抑制有害菌 产 生多种有益动物生长的酶 氨基酸 维生素及生 长因子等 起到营养作用 同时有些益生菌也具 有免疫作用 可刺激促进动物免疫系统发育及提 高免疫力功效 目前 有关益生菌研究方面的文 章很多 但多局限于研究进展及对新产品功效方 面的介绍 有关优良益生菌菌株的筛选及使用过 程中应注意的基本问题 很少有见报道 笔者结 合近三年对益生菌的研究 着重介绍了益生菌菌 株在筛选和应用过程中应注意的几个问题 1 筛选中应注意的几个问题 1 1 初筛及鉴定问题 菌株的筛选是一个相当头痛的事情 但利用 有些益生菌菌株所具有的特性 我们可以对其进 行简单的初步筛选 笔者曾利用豆鼓进行了益生 菌纳豆芽孢杆菌的筛选鉴定工作 结合大量的研 究报道 利用纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶这一特性 通过反复和纤溶活性实验及对发酵后豆制品进行 拔丝实验 初步筛选出纤溶活性强及拔丝性能好的 菌株 对其进行鉴定并得到了所需的纳豆芽孢杆菌 菌株 利用相关特性 简单的进行初筛 在益生菌 菌株的筛选和鉴定上可以节省一些工作量 1 2 菌株对温度的耐受性问题 益生菌菌株在制粒的过程中经常遇到8 0 一 1 0 0 C 的瞬时高温膨化 所以我们必须对鉴定出来 的菌株进行温度的耐受性实验 菌株对温度的耐受 性越强 其菌剂产品的活性保存时间也会越长 菌 剂越不容易受温度影响而死亡 般将菌株培养至对数生长末期或是稳定期 取用发酵液l m l 无菌操作将其稀释至一定的倍 数 对最后两个梯度分别稀释若干支 分别置于一 定的温度 其温度视膨化温度而定 中水浴5 m i n 1 0 m i n 1 5 m i n 和2 0 m i n 流水冷却 以室温下未经 水浴的菌株作为对照 采用平板计数法计算水浴后 的存活率 据此判断其对温度的耐受性 某一温度 条件下的存活率越高 则菌株对这一温度条件的耐 受能力越强 存活率 奎瓷竿罢鲁器黼 o o 1 3 菌株对p H 的耐受性问题 般动物肠道的p H 多为p H 2 3 及p H 5 7 两 个范围 益生菌对p H 有较强的耐受性 特别是对 2 2 9 瓣壤 箕 囊篇茎瓣孽 全国功能性生物制品生产与应用技术交流展示会论文集 动物肠道这两个范围的p H 值有强的耐受性 是它 进入肠道后增值和发挥作用的前提条件 另外 在菌剂的保存和使用过程中 也常常会遇到不同 的p H 因此 对p H 有较强的适应性是很有必要 的 进行菌株对p H 的耐受性实验可采用两种方 法 方法一 配制不同的p H 缓冲液 在配制的过 程中每个p H 都做两份 一份用于测定灭菌后的 p H 将菌株在同样配制 不同p H 的缓冲液中培养 一定时间 比如6 0 m i n 取用培养液l m l 适当稀释 后涂布平板计数 计算相对存活率 以此判断其 p H 的耐受性 方法二 配制不同p H 的培养基 在配制的过 程中每个p H 都做两份 一份用于测定灭菌后的 p H 取用发酵液1 m 适当稀释后涂布不同p H 的培 养基上 平板计数 计算相对存活率 以此判断 其p H 的耐受性 某一p H 条件下的相对存活率越高 则菌株对 这一p H 的耐受性越强 相对存活率 黄篇羞需嚣箨黼舢 1 4 菌株对抗生素的耐受性问题 尽管抗生素的使用带来了较强的副作用 但 是现在许多学者在谨慎之余也提出了抗生素的亚 治疗量概念 即先用极少量的抗生素杀死肠道内 的病原菌 然后用益生菌对肠道内的有益菌群进 行补充和平衡 因此 益生菌对抗生素的适应能 力越强 则就越能与抗生素进行配伍协调式的同 时使用 菌株对抗生素耐受性实验可以采用两种 方法 方法一 采用一些饲料公司提供的抗生素及 推荐剂量进行实验 用打孔器打出直径为6 r a m 的 圆形纸片 将各种抗生素按推荐剂量进行稀释 将圆形纸片浸入对应的抗生素溶液中 浸泡2 小 时 取出后阴干备用 将菌体培养至对数生长末期或稳定期后 与 经熔化后在水浴中冷却至4 5 5 0 0 C 的固体培养基混 匀 约保持菌数在1 0 9 1 0 1 0 个 m l 之间 取用1 5 m l 倒平板 待平板干固后 用无菌镊子将阴干的纸 片贴于平板上 培养一定时间后测定抑菌圈的大 小 方法二 按上述方法配制好各抗生素溶液和 2 3 0 接入了菌株的培养基 待培养基干固后 在培养 基表面放上经灭菌的牛津杯 一般每个平皿可放 3 4 个牛津杯 用取液器向牛津杯中注入5 0 u 1 的 抗生素溶液 培养一定时间后测定抑菌圈的大小 以上两种方法只以定性的测定菌株对某一抗 生素的耐受性 如果需要进行定量的分析 可将 某一不同单位浓度的抗生素按照上述任一方法对 菌株进行实验 根据实验结果 对抑菌圈与抗生 素的单位浓度进行回归分析 得到数学表达式 然后根据数学表达式求出实验中相应抑菌圈对应 的抗生素单位 实验中常用的抗生素有阿散酸 杆菌肽锌 金霉素 喹乙醇 痢特灵及球克等 1 5 菌株的抑菌能力问题 将鉴定所得的菌株培养至对数生长末期或是 稳定期 然后在一定转速 笔者实验中常采用 3 5 0 0 r p m 下进行离心 得上清液 将待实验的菌 株采用涂布或倾注平皿法接种对应的固体培养基 待干固后再在平板上贴上6 r a m 的无菌干纸片 然 后在纸片上点1 0 u l 的所得菌株上清液 在实验菌 株所需的培养条件下培养一定时间后 测定抑菌 圈 对有害菌的抑菌圈越大 对有益菌的抑菌圈 越小 则菌株折抑菌效果越好 常用实验菌株有大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 沙门氏寒菌 枯草芽孢杆菌 乳酸杆菌 酵母菌 及黑曲霉等 1 6 菌株的产酶活力问题 参考相关酶活力测定的方法 将菌株培养一 定时间后离心 取上清液进行蛋白酶 淀粉酶及 纤维素酶等酶活力的测定 选用产酶活力相较高 的菌株 1 7 小结 当然这些方法也具有一定的局限性 无论是 对菌株的耐受性实验 还是对菌株的抑菌能力及 产酶活力实验 其结果都不可避免的受到培养基 组成 培养条件等因素的影响 但是这些方法依 据益生菌的作用机理 对其使用效果在体外进行 了充分的模拟 对优良益生菌菌株的筛选具有很 强的指导意义 笔者曾采用上述的方法 从不同 的纳豆芽孢杆菌菌株中筛选出了对温度 p H 抗 生素有较强耐受性 对病原菌有强抑制能力和同 有益菌有良好共生能力 同时又具有较好产蛋白 全国功能性生物制品生产与应用技术交流展示会论文集 蠡爨誊簿黪鞴琴褰鹫 酶 淀粉酶和纤维素酶能力的优良益生菌纳豆芽 孢杆菌菌株K T 一9 此菌株现已被某一饲料公司所 采用 2 应用中应该注意的几个问题 尽管益生菌具有良好的使用效果并已经得到 公认 但是仍然有许多问题需要得到解决 2 1 产品质量难以统一及行业管理困难 部分益生菌产品质量不稳定 生产处于复配 仿制阶段 检测手段不够完善 产品的标准和检 测方法尚显混乱 其主要表现在菌种的来源 活 菌质量标准 卫生学标准 储存与有效期等问题 上 优秀的检测人员不足 造成市场上益生菌产 品良莠难辨 在这一方面J M T H a m i l t o n M i l l e r 针 对具体的市场及产品问题列举大量的事例进行了 阐述 因此 急需建立完善的行业检测标准 制 定有关法规的实施细则 使生产与宣传规范化 2 2 益生菌的使用问题 益生菌在储运加工过程中 高温 胃酸 胆 汁酸盐等均能使其失活 如何保证在使用的产品 中 含有足够活力和数量的微生物 并能在到达 动物体内后依然保持较强的活性 这依旧是一个 需求解决的问题 T M a t t i l a S a n d h o l m 等对益生菌 在菌种的选择 产品活性的保存等使用方面的问 题进行了详细的研究和论述 并提出了一些良好 的建议 在产品活性的保存方面 目前常采用真空冷 冻技术和微胶囊等技术 亦采用真空包装或是充 氮气包装等形式 使问题的解决取得了一定的进 展 K h a l i d a 等采用海藻酸钠与淀粉作为囊材对一 些益生菌进行包埋 并对包埋的各种参数 如制 粒大小等进行了研究 取得了较好的成效 C o l e t t e D e s m o n d 等对乳酸杆菌的喷雾干燥过程进行了深入 的研究和探讨 除此之外 我们还必须考虑如何根据不同的 动物选用不同菌种的益生菌以及解决其治疗效果 不如抗生素明显和稳定等问题 2 3 安全性问题 黄庆生 杨泉海和J o h n 0 7 B r i e n 对益生菌安全 性问题的研究较为全面 他们对安全性问题的担 忧主要表现在如下几个方面 携带并转移抗生素抗性基因 产生耐药因子 的可能性 耐药性微生物携带的某种抗生素抗性 基因可能随着质粒的迁移而在不同种属之间进行 传递 然而就目前而言 市场上的益生菌基本上 都是野生菌株或是经驯化培育而成的菌株 有些 没有用分子生物学的方法进行这些方面的检测 未能有效地控制和解决这一问题 比如 M o r e l l i 等在不同类的乳酸杆菌中发现了肠球菌的p A M b l 质粒 遗传修饰生物应用的可行性问题 有些转基 因过程中的某些不确定因素导致目的基因不能实 现定向转移 反而带来负面影响 如非病原性转 变成病原性菌株 宿主范围改变 毒性改变等使 得遗传修饰微生物应用的可行性成为问题 同时 当正常的微 生物区系被打破后 还 必须考虑由此而可能导 致正常动物微生物区系 的扰乱 特定环境下有 害代谢产物的产生以及 潜在的致病性问题 比 如 被人们认为是安全 可靠的乳酸杆菌近几年 也有不少关于由其引起 的临床感染报道 这些都警示我们应 尽快完善菌株安全性方 面的实验检测手段 2 3 1 益生菌菌株的筛选及应用中应注意的几个问题益生菌菌株的筛选及应用中应注意的几个问题 作者 杨晓斌 谢拥葵 韦燕鹏 作者单位 广州番禺梅山 马利酵母有限公司 相似文献 10条 相似文献 10条 1 学位论文 曾东 鲤益生菌的筛选 生物学特性及作用机理的研究 2009 本研究从鲤 Cyprjnus carpio 肠道及养殖水体分离筛选具有耐热和抑制病原菌功能的益生菌 并对其进行鉴定 在体外研究了部分益生菌对鲤前 肠粘液的粘附特性及对病原菌粘附的抑制作用等生物学特性 并探讨了所筛选的枯草芽孢杆菌 肠球菌及光合细菌等3株益生菌对鲤肠道免疫机能 消化 酶 肠道菌群结构与多样性及鲤肌肉品质 生长性能等的影响 各试验的研究结果如下 试验一 试验二中 从养殖池 水族箱和健康鲤肠道等分离20株细菌 以及四川农业大学动物微生态研究中心提供的8株供试细菌共28株 通过耐热 和体外拮抗试验筛选出5株细菌 经生化试验和细菌16S rDNA测序鉴定为2株芽孢杆菌 Bacillus 2株肠球菌 Enterococci 和1株柠檬酸杆菌 Citrobacter 进一步采用体外固定鲤前肠黏液蛋白 结合同位素32P标记细菌并示踪的方法 研究来源于鲤肠道的肠球菌和柠檬酸杆菌以及鲤养殖 水体中的芽孢杆菌对鲤前肠黏液的体外黏附活性 建立筛选鲤益生菌的方法 结果表明 5株细菌均能黏附到黏液体外模型 肠球菌的相对黏附率极显著 高于芽孢杆菌与柠檬酸杆菌 P0 05 而肠球菌L2的相对黏附率极显著高于肠球菌 E2 P 0 01 结果证明 鱼源的肠球菌对鲤前肠黏液的黏附率高于异源的芽孢杆菌 而且不同种属的肠球菌在黏附能力上也存在差异 试验三 试验四中 选择枯草芽孢杆菌制剂 B组 由Z2菌株制成 枯草芽孢杆菌和光合细菌 四川农业大学动物微生态研究中心提供 混合制剂 C组 枯草芽孢杆菌和肠球菌 由L2菌株制成 混合制剂 D组 3种益生菌组合 并将每一种制剂在同一浓度水平与对照组 A组 进行比较 分析 试验组对鲤鱼免疫功能及鲤肠道消化酶的影响 结果表明 试验B组 C组中鲤的白细胞吞噬 杀菌活性 血清溶菌酶活性与对照组A差异显著 P0 05 证明 单独使用枯草芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌和光合细菌复合制剂 以及枯草芽孢杆菌和肠球菌复合制剂更能有效地提高鲤鱼的白细胞的吞噬活性 杀菌活 性和血清溶菌酶活性 同时 结果还表明 试验后期B组淀粉酶比活显著提高 P 0 05 脂肪酶 胰蛋白酶比活力极显著提高 P 0 01 C组 D组 胰蛋白酶比活力极显著提高 P0 05 特别是D组与A组的淀粉酶比活力在各阶段差异均 不显著 P 0 05 在整个试验中 B组对鲤肠道消化酶比活的提高效果最好 试验五中 采用PCR DGGE技术研究了不同组合的益生菌制剂对鲤肠道菌群结构与多样性的影响 结果表明 B组 C组和D组均能提高鲤肠道菌群的多 样性 其中 试验B组鲤肠道菌群的多样性 优势菌群条带较对照组A明显提高 到42 d时条带增加量为9条 而试验C组鲤肠道菌群的多样性 优势菌群 高于对照组A 到42 d时条带增加量为4条 但效果没有试验B组好 而D组的效果不明显 试验六中 研究了不同益生菌组合对鲤肌肉氨基酸含量 肉质及生长性能的影响 结果表明 在生长方面 与对照组相比 试验B C D组试验组鲤 的生长性能指标均高于对照组 其中B组的丰满度 绝对生长率 相对生长率 瞬时生长率 生长比速等均达到同阶段的峰值 与对照组相比 试验B C组绝对生长率与瞬时生长率显著提高 P 0 05 在肌肉品质方面 与对照组相比 添加益生菌的3组试验组 B C D组 鲤肌肉粗脂肪含量 失 水率极显著降低 P 0 01 肌肉粗蛋白含量显著增加 P鼠李糖乳杆菌 假丝酵母 嗜酸乳杆菌 枯草芽孢杆菌 纳豆芽孢杆菌 同一菌株对两种肠黏液的黏 附能力无明显差别 但不同菌株对肠黏液的黏附能力则存在较大的差异 各菌株表面疏水性存在较大差异 其中黏红酵母表面疏水性最强 嗜酸乳杆菌 疏水性最弱 枯草芽孢杆菌 纳豆芽孢杆菌及鼠李糖乳杆菌的表面疏水性处于中间水平 所测试的6株益生菌的表面疏水性与其黏液黏附能力之间无明显 相关性 结论 黏红酵母和鼠李糖乳杆菌对牙鲆及大菱鲆肠黏液都具有较强黏附能力 这种黏附能力具有种属特异性 受宿主黏液影响较小 3 黏红酵母黏附牙鲆肠黏液的影响因子研究 采用MTT比色法研究了pH 温度 二价阳离子对黏红酵母黏附作用的影响以及不同生长阶段的黏红酵母 对牙鲆黏液的黏附特点 结果显示 在10 30 黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附随温度升高而增强 中性偏酸的环境有利于黏红酵母的黏附 Ca2 能显著 增加黏红酵母的黏附 但Mg2 促黏附作用不明显 处于对数生长期的黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附能力最强 其次是延滞期的酵母 而稳定期和衰亡期 的黏红酵母黏附能力显著减弱 上述结果说明黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附作用不仅受多种环境因子的影响 也受其自身生理状态的影响 其黏附作用 具有可控性 这对黏红酵母在牙鲆肠道内黏附 定植的调控有一定的参考价值 4 黏红酵母和鼠李糖乳杆菌在牙鲆肠道的定植 将上述两种益生菌添加到基础饲料中连续投喂牙鲆21d 然后改投基础饲料继续饲养14 d 试验组 对照组一直投喂基础饲料 分别于试验的第0 7 14 21 28 35d取样测定牙鲆肠道弧菌 乳酸菌及酵母数量 计算对照组与试验组牙鲆的成活率 结果表明 前21d试验组牙鲆肠道黏红酵母数量达到了104 cfu g 1 乳酸菌数量达到106cfu g 1 显著高于对照组 试验组牙鲆肠道弧菌总数随黏 红酵母及鼠李糖乳杆菌的增加而减少 并显著低于对照组 改投基础饲料后 试验组牙鲆肠道两种益生菌在肠道中的数量明显减少 但仍高于对照组 弧菌总数有所增加 但显著低于对照组 试验组牙鲆成活率高于对照组 结论 黏红酵母和鼠李糖乳杆菌能够在牙鲆肠道定植 并能降低牙鲆肠道弧 菌总数 降低牙鲆死亡率 因此具有较好的应用前景 5 黏红酵母表面黏附相关蛋白及黏液受体的初步研究 前期的试验发现黏红酵母对大菱鲆肠黏液具有较强黏附能力 为进一步了解其黏附机制 采 用Western blot技术 对黏红酵母表面黏附蛋白和肠黏液受体进行了初步研究 结果表明 黏红酵母表面蛋白预先与肠黏液孵育2h后 显著抑制了黏红 酵母与肠黏液的结合 其黏附百分率下降了83 6 Western blot显示黏红酵母表面蛋白中分子量为38 5 ku和28 6 ku的两个蛋白参与对肠黏液的黏附 过程 大菱鲆肠黏液中分子量为27 3 ku和22 3 ku两个蛋白可与黏红酵母表面蛋白特异性结合 糖原染色显示上述四个蛋白均为糖蛋白 6 鼠李糖乳杆菌通过Toll样受体信号途径诱导牙鲆天然免疫反应 为阐明Toll样受体信号途径在鼠李糖乳杆菌诱导牙鲆天然免疫反应中的作用 将 鼠李糖乳杆菌和牙鲆巨噬细胞共同培养2h 然后用半定量反转录PCR法分析巨噬细胞Toll样受体 TLR2 TLR22 及肿瘤坏死因子 TNF mRNA的表达情况 用凝胶阻滞电泳测定核转录因子NF B的活化状态 结果表明巨噬细胞经鼠李糖乳杆菌刺激后TLR22 TLR2及TNF mRNA表达量显著增加 凝胶阻滞 试验也证实鼠李糖乳杆菌刺激后巨噬细胞核转录因子NF B被激活 为进一步评价胞外信号调节酶 ERK p38MAPK及核转录因子NF B在鼠李糖乳杆菌 诱导巨噬细胞TLR2 TLR22和TNF mRNA表达中的作用 巨噬细胞先用ERK p38MAPK及NF B特异性抑制剂PD98058 SB203508和BAY11 7082分别预处理 1h 然后再与鼠李糖乳杆菌共培养2h 结果显示p38MAPK抑制剂SB203580预处理巨噬细胞1h后 显著抑制了巨噬细胞TLR22 TLR2及TNF mRNA的表达 抑制核转录因子NF B也显著降低了TNF 的表达 但是不能抑制巨噬细胞TLR22 TLR2 mRNA的表达 综上所述 鼠李糖乳杆菌可能通过TLR22 TLR2介 导的信号途径诱导TNF mRNA的表达 从而起始牙鲆天然免疫反应 而p38MAPK信号途径参与了巨噬细胞TLR22 TLR2及TNF 基因的表达调控 3 会议论文 袁杰利 阴道益生菌制剂及其应用 2004 本文首先论述了微生态学的发展与研究的主要内容 其次 探讨了有关阴道菌群的九个方面的问题 包括 1 阴道正常微生物群的构成 2 健康 妇女阴道菌群特点 3 阴道菌群失调的生态防治 4 益生菌的定义 5 阴道益生菌制剂的作用机制 6 阴道益生菌生产菌株的筛选 7 阴道保健与 生态消毒剂 8 乳杆菌制剂在细菌性阴道病治疗中的应用 9 阴道生态与平衡与艾滋病的预防 最后 对阴道益生菌制剂的趋势作了展望 4 学位论文 王巍 具有降胆固醇功能益生菌的筛选 2009 血清胆固醇水平偏高是世界上导致人类死亡率较高的心血管疾病的主要病因之一 通常传统药物治疗作用单一 副作用较多 而通过减少或降低外 源性胆固醇的摄入量则是目前调节机体胆固醇水平偏高所普遍采用的措施 益生菌在发挥调节肠道等诸多功能的同时 可以达到单纯降低胆固醇而不影 响其他营养物质吸收的效果 因此已引起世界相关领域的高度重视 寻找 筛选并优化出具有降胆固醇功能的益生菌以及科学的益生菌体外筛选方法的 确定对于确保益生菌生物功效 安全性以及质量稳定性及产品开发都有着至关重要的作用 本课题研究结果表明 1 采用进一步确定的硫酸铁铵法对43株益生菌进行研究 筛选出4株具有较高胆固醇脱除率的候选菌株 即DM84031 63 1 DM84034 70 3 DM8503 81 1 DM86056 63 1 并经过形态学及生理生化特征鉴定 确定4株候选菌株分别为保加利亚乳杆菌 嗜热链球菌 詹氏乳杆菌 屎链球 菌 2 在进一步对候选菌株耐酸 耐胆盐能力以及抑菌能力等生物学特性进行考察的同时发现 候选菌株DM86056还具有对抗生素相对稳定的优势 因 此将其作为试验菌株进行深入研究 3 通过候选菌株对胆固醇的代谢及生理特征的对照研究 分析表明 4株具有较高胆固醇脱除率的候选菌株在体外发挥降胆固醇作用时具有一定程 度的吸附及同化胆固醇的作用 进一步确认了其生物学功效并验证了益生菌吸收胆固醇这一机理的存在 4 通过针对喂食试验菌株DM86056的肉鸡 对照组和实验组肉鸡各100羽 的各项指标 血清 胸肌 腿肌 肝脏组织中的胆固醇含量 进行考察 结果 表明 候选菌株DM86056对除肝脏以外的其他组织及血清胆固醇含量作用明显 因此具有一定的开发价值 研究结果证实 科学的益生菌体外筛选方法能确保其生物功能 为适应不同种属菌株的生长代谢和生理特性还有待于对益生菌包括其降胆固醇机制 进行深入研究 从而推动益生菌产业的发展 5 学位论文 周洁 具有血管紧张素转换酶抑制活性的益生菌筛选 2009 本课题是国家高新技术研究发展计划 863计划 益生菌定向筛选关键技术及产品开发研究 2007AA102356 的重要内容 此次研究通过对具有血 管紧张素转化酶 ACE 抑制功能的益生菌进行体外筛选及评价 得到高活性的候选菌株 并在对这些候选菌株的微生物形态 生理特征及生物功能研究基 础上进行发酵产物的分离纯化及生物活性验证 以确保其生物功效的发挥 旨在对其ACE抑制作用的探讨 研究结果表明 1 通过对报道的体外ACE测定方法的综合比较 确定可见分光光度法具有准确 简便 稳定等特点 在所确定的脱脂乳作为益生菌发酵条件及其影响 因素考察的基础上 筛选出6株高活性的候选菌株 DM84011 DM8319 DM8320 DM8308 DM84013 DM8317 2 通过对候选菌株发酵离心液以pH8 3硼酸缓冲盐为洗脱液 进行葡聚糖凝胶SephadexG 50层析 并采用考马斯亮蓝比色法及SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳对分离到的组分进行质量分析 结果表明 分离出的小分子肽具有较高的ACE抑制活性 3 通过对候选菌形态学及生理生化特征分析表明 6株候选菌株为不同菌属 初步鉴定菌株DM84011为保加利亚乳杆菌 菌株DM8319为植物乳杆菌 菌株DM8320为罗伊氏乳杆菌 菌株DM84013 DM8308为长双岐杆菌 菌株DM8317为嗜酸乳杆菌 菌株DM84023为嗜热链球菌 其中菌株DM84013具有较好 的生物体内适应性和ACE抑制活性 4 通过对候选菌发酵液的不同分离物及提取物抗氧化能力的进一步评价 证明菌株DM84013抗氧化作用较为突出 由于益生菌的种属 生理及代谢特征的不同 使其在ACE抑制活性及抗氧化等方面存在着差异 而对益生菌深入研究并且进行产品开发的关键 是要 完善其体外筛选方法和评价模型体系的构建 同时 本实验的研究结果也有待于在生物体功效方面做进一步的验证以提高其性能 6 学位论文 闵钟熳 动物益生芽孢杆菌菌株的筛选及发酵条件优化研究 2007 益生菌 probiotics 是一种能够直接饲喂 并且可以通过改善寄主肠道菌群平衡而对动物产生有益作用的活的微生物饲料添加剂 近年来由于抗生 素的滥用引起的毒性 药物残留 耐药性 环境污染等问题剧增 给人类的生存和发展造成严重的负面影响 因此寻找安全 无毒的抗生素替代品显得 尤为重要 长期的实践和大量研究表明 作为动物微生态制剂的一种 芽孢杆菌不仅能抑制动物肠道内的病原菌 还能够产生多种营养物质 对维持动 物机体正常的生理状态和生长繁殖都有重要意义 本研究根据益生菌筛选的常规方法和芽孢杆菌的判定标准 从健康动物肠道中分离出680株芽孢杆菌进行筛选 经过耐胆酸盐试验结果有75株能够在 含0 3 w v 的牛胆酸盐培养基中生长 75株芽孢杆菌中有16株能够抑制大肠杆菌 其中有6株能同时抑制肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌 对它们再进 行耐胆酸盐复筛试验 获得4株芽孢杆菌 经过胃液 肠液 产酶试验得到一株具有优良性状的芽孢杆菌B544 该菌株在pH值为2 0的模拟胃液中2h存活 率为21 4h存活率为5 在pH值为3 0 pH值为4 0的胃液中能够缓慢生长 在模拟肠液中生长几乎不受抑制 该菌株还具有产淀粉酶 蛋白酶 木聚 糖酶的能力 通过培养特征 生理生化特征及16SrDNA序列分析对菌株B544进行菌种鉴定 初步确定为枯草芽孢杆菌命名为Bacillus spp 544 经培养条件和培养基优化试验 初步确定此菌株培养条件为 起始pH值为7 0 7 3 装液量40mL 300mL 种子液培养15h 接种量5 v v 控制培 养温度37 40 最佳培养基成分配比为 玉米淀粉1 0 KHPO KHPO0 4 豆粕粉2 0 麸皮4 0 活菌数可达 3 47 10cfu mL 7 学位论文 李善仁 混菌发酵豆粕制备大豆肽的研究 2009 大豆肽是大豆蛋白经水解得到的低分子肽混合物 具有比大豆蛋白更优越的理化特性和生理功能 在食品 医药和饲料添加剂中具有广泛的应用前 景 微生物发酵是制备大豆肽的方法之一 由于其将蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产有机地结合在一起 降低了大豆肽的生产成本 同时克服了 酶水解法制备大豆肽产品的苦味大和口感差等缺点 目前利用微生物发酵法生产大豆肽被认为是一种较先进和有效的方法 应用前景较好 本论文以工业副产物豆粕为原料 利用微生物混合发酵技术来制备大豆肽 以期获得具有肽营养和益生特性的饲料添加剂 本试验通过筛选产蛋白 酶活性较高的芽孢杆菌 在体外研究其益生特性 并与米曲霉进行配伍筛选能混合发酵豆粕制备大豆肽的菌株组合 利用正交试验和响应面分析法分别 对混菌发酵条件和发酵培养基进行优化 为大豆肽的工业扩大生产提供了参考 结果如下 1 产蛋白酶芽孢杆菌的筛选 试验以蛋白酶活力和水解度为指标 结合液体发酵和固体发酵工艺考察菌株的发酵能力 从而筛选优良的豆粕发酵 菌株 结果表明 通过初筛和复筛获得3株能较好发酵豆粕的芽孢杆菌CS16 CS21 CS27 为后续研究奠定了基础 2 芽孢杆菌益生特性的体外研究 模拟胃肠道环境 研究3株芽孢杆菌的耐受存活情况 同时对肠道中致病性金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 肠炎 沙门氏菌拮抗特性 产酶特性和急性毒性安全性试验进行研究 表明在4h内 人工胃液中存活率在15 50 之间 胆盐和人工肠液中存活率在50 以 上 对病原菌抑菌圈直径在10 以上 具有较好的蛋白酶和淀粉酶活性 急性毒性试验LD50 20g BW 表明这3株芽孢杆菌可以作为饲用微生态制剂的 候选菌种 3 混菌发酵豆粕菌株的筛选及鉴定 利用平板混合培养和实际发酵相结合的方法筛选发酵豆粕的最佳菌株组合 并对筛选的芽孢杆菌进行鉴定 结果获得能和米曲霉配伍的芽孢杆菌CS27 经鉴定CS27为枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 4 混菌发酵制备大豆肽的发酵工艺研究 利用正交试验和响应面分析法分别对混菌发酵条件和发酵培养基进行优化 结果表明在豆粕中添加 5 的麸皮 料水比为1 1 149 MgSO40 048 糖蜜0 294 培养基条件下 芽孢菌与米曲霉同时接种 接种比例为2 1 30 下发酵48h 大豆肽 含量为21 74 比未经发酵处理豆粕中大豆肽含量 3 54 提高了5 1倍 为豆粕发酵工艺扩大提供了参考 8 期刊论文 于景华 李里特 吕加平 张国钰 王建 YU Jing hua LI Li te LU Jia ping ZHANG Guo yu WANG Jian 具有肠道吸附能力的益生菌菌株筛选研究 中国乳品工业2006 34 8 通过将经耐酸 耐胆汁盐筛选的15株乳酸菌利用HT 29细胞系进行肠道吸附能力的体外筛选试验 结果得到具有较强吸附能力的菌株7株 同时对益生 菌的吸附特性进行了初步的探讨 9 期刊论文 王巍 邹积宏 袁杰利 WANG Wei ZOU Ji hong YUAN Jie li 具有降胆固醇功能益生菌的筛选研究 中 国微生态学杂志2009 21 4 目的 通过体外实验从发酵制品及人体肠道内分离筛选出安全高效的降胆固醇乳酸菌 并研究其生理生化特性 为今后功能性乳制品的开发提供优良菌 种 方法 应用MRS 胆固醇培养基液体发酵法进行目的菌株筛选 并测定其耐酸及耐胆盐等能力 结果 筛选出4株具有降胆固醇能力的乳酸菌 其降解率分别 为DM84031 63 1 DM84034 70 3 DM8503 81 1 DM86056 63 1 同时4株乳酸菌均表现出不同程度的耐酸及耐胆盐能力 其中DM86056能力最强 其他 3株乳酸菌次之 经鉴定 DM84031为保加利亚乳杆菌 DM84034为嗜热链球菌 DM8503为詹氏乳杆菌 DM86056为屎肠球菌 结论 经上述实验综合比较 DM86056降胆固醇能力比较强且耐酸及耐胆盐等能力也较强 因此有待于将其应用于动物体内进行深入研究 10 学位论文 吴光伟 工业化条件下生产鼠李糖乳杆菌 ATTC53103 高密度冻干菌粉的研究 2009 鼠李糖乳杆菌 ATTC 53103 是目前全球研究较多的益生菌之一 对人体有着丰富而显著的功能特性 该菌株具有耐胃酸 耐胆汁 可定植于人体 肠道 产品保