蛋白质和多肽的 N 端测序技术研究进展.pdf

214 中国医药生物技术 2008 年 6 月第 3 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol June 2008 Vol 3 No 3 综述 蛋白质和多肽的 N 端测序技术研究进展 赵丽艳 张养军 钱小红 氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径 N 端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位 其序 列特异性很高 通过 N 端的少数几个氨基酸残基就可以对 大多数蛋白质进行鉴定 1 例如 可以通过对蛋白质和多肽 类药物的 N 端进行人工修饰 如环化修饰 甲基化修饰 等 提高其降解稳定性延长药效 2 3 因此 N 端肽段的鉴 定具有非常重要的意义 本文对近年来蛋白质和多肽 N 端 测序技术及方法进行了综述 1 蛋白质和多肽 N 端的重要生物学功能 所有蛋白质合成都起始于 N 端 其序列组成对其生物 学功能有着巨大的影响 蛋白质的半衰期与 N 端氨基酸 的特异性有关 或者说 N 端氨基酸残基对蛋白质的寿命有 控制作用 4 N 端序列与蛋白质的亚细胞器定位有密切关 系 例如 某些特殊的氨基酸序列可以作为蛋白质分选标记 影响蛋白质定位 5 蛋白质的 N 端可发生许多种翻译后 修饰 影响其结构和功能 如在新生肽链的成熟过程中 2 3 的叶绿体蛋白质会发生起始甲硫氨酸残基的剪切和前导肽 的去除 6 又如核心组蛋白 N 端赖氨酸的可逆乙酰化修饰 使组蛋白与 DNA 间的作用减弱 导致染色体局部解旋 促 进基因转录 而去乙酰化则抑制基因转录 7 这种乙酰化和 去乙酰化过程中的任何异常都会导致生长 发育的紊乱 诱 发白血病 皮肤癌等疾病 8 因此 通过对蛋白质 N 端序 列的研究有利于分析蛋白质的高级结构 揭示蛋白质的生物 学功能 2 蛋白质和多肽 N 端测序技术 2 1 非质谱技术 1955 年 Frederick Sanger 采用二硝基氟苯 FDNB 法 首次成功地完成了第一个蛋白质 牛胰岛素的序列分 析 在此测序方法的基础上 瑞典有机化学家 Edman 9 提 出了蛋白质 N 端顺序测定方法 Edman 降解 之后随着 基于此原理的液相 固相及气相自动蛋白质序列分析仪的推 出和逐步完善 经典的 Edman 降解法已经广泛应用于蛋白 质的 N 端测序 Chen 等 10 在微流控芯片上进行 Edman 反应 使得肽段测序的灵敏度提高到亚飞摩尔水平 并利用 Edman 反应 2 次循环得到肽段的串联质谱 MS MS 图的 b2 离子为内标 获得了更好的二级质量准确度 11 实现了 肽段快速 可靠的测序 但 Edman 降解方法受到以下诸多限制 用于序列分 析的蛋白质或多肽必须是高纯度的 N 端封闭的蛋白质 难以进行 Edman 反应 虽然出现了一些去除 N 端封闭基 团的方法 例如用蛋白酶去除 N 端焦谷氨酸和通过酸催化 的亲核取代去除 N 乙酰化丝氨酸和 N 乙酰化苏氨酸残 基 12 等 但都只适于一定残基的特定修饰 没有普遍适用 性 且许多末端残基修饰是无法移去的 不适于高通量分 析 灵敏度不够 13 但是 Edman 降解对于整体纯化的蛋白 的 N 端序列分析仍是很有价值的研究工具 人们还利用 RT PCR 从编码蛋白质的 mRNA 得到其 cDNA 序列 再根据遗传密码表反推出其相应的氨基酸序 列 20 世纪 80 年代出现了从基因组中找出编码蛋白质的 基因 测定其 DNA 序列 再反推出蛋白质的氨基酸序列 的技术 其特点是更加简便 快速 但利用 RT PCR 或测 定基因组的碱基序列也不能完全描述蛋白质的一级结构 它 对翻译加工所导致的氨基酸残基的修饰及突变等情况无能 为力 2 2 质谱技术 质谱 MS 尤其是电喷雾 electraspray ionization ESI 和基质辅助激光解吸电离 飞行时间 matrix assisted laserd desorption ionization time of fight MALDI TOF 的出 现 使质谱技术在蛋白质结构分析中的应用发生了革命性的 飞跃 高灵敏度 高准确性 高分辨率和高通量的生物质谱 技术为蛋白质的 N 端测序提供了一种重要的选择 2 2 1 阶梯式测序 是间接肽序列测定技术 14 通过末端 酶解或化学降解产生一组相互之间仅差一个氨基酸残基的 多肽系列 经 MALDI TOF MS 鉴定后 根据所得到的肽 阶梯图中各肽段的相对分子质量差值确定末端的氨基酸序 列 从而用于数据库查询 阶梯测序是最早探索用质谱进行 蛋白质测序的例子 15 经过几个 Edman 反应循环的肽段混 合物被 MALDI MS 检测 原始肽段的序列就可从质谱测得 的梯形序列里得到阐明 另外 Zhong 等 16 还提出了质谱 结合微波辅助酸水解的阶梯式测序方法 通过 25 的三氟 乙酸溶解蛋白质 用普通微波辐射 10 min 后 用质谱直接 检测其酸水解的梯度产物进行蛋白质序列的分析 2 2 2 化学标记结合质谱 许多对末端肽的研究方法采用 的是质谱技术与多种化学方法及生物酶法的结合 通过 N 端的各种化学标记 运用 MS MS 或多级质谱 MSn 的碰 基金项目 国家自然科学基金 20505018 20635010 国家高技术研 究发展计划 863 计划 2006AA02A312 国家重点基础研究发展规 划 2006CB91080 2007CB914104 作者单位 102206 北京 军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白 质组学国家重点实验室 北京蛋白质组研究中心 通讯作者 钱小红 Email qianxh1 收稿日期 2008 03 13 中国医药生物技术 2008 年 6 月第 3 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol June 2008 Vol 3 No 3 215 撞诱导裂解 collision induced dissociation CID 17 源后 裂解 post source decay PSD 18 等碎裂技术测序 或标 记的 N 端肽段先经过选择性的分离 再进行从头测序 19 Noga 等 20 通过 N 端肽的乙酰化 氘代乙酰化的 1 1 修饰 运用快原子轰击 fast atom bombardment FAB 质谱 进行标记 N 端肽的鉴定 Keough 等 21 首先发现 通过在 酶切肽段的 N 端引入带一个单位负电荷的磺酸基 有利于 肽段的从头测序 这种酰化修饰可以促进肽链酰胺键在 MALDI 源质谱中的断裂并抑制 N 端碎片离子的生成 产 生连续的 y 离子系列 本实验室曾通过邻磺基苯甲酸环酐 对蛋白质的 N 端肽进行磺酸化修饰 使其在一级负离子模 式下成为便于识别的基峰 并通过 MALDI MS 的 PSD 二 级质谱分析 形成连续的 y 离子系列碎片 实现了对 N 端 肽序列的测定 22 Yamaguchi 等 23 24 将蛋白质经过还原 烷基化和侧链氨基的胍基化封闭 用不同的生物素类试剂标 记自由的 N 端 标记后的蛋白质经胰蛋白酶酶切后 通 过抗生物素亲和体系将标记的 N 端肽分离出来 再通过 MALDI TOF MALDI TOF PSD MS 从头测序 获得了 N 端肽的序列 Gevaert 等 25 提出对角线色谱法 combined fractional diagonal chromatography COFRADIC 进行 N 端 肽的研究 利用肽段在末端氨基的 2 4 6 三硝基氟苯修 饰前 后在反相色谱上的色谱行为的差异定位 N 端肽 从 人血小板的细胞质和膜骨骼蛋白质组分中鉴定出 305 个 N 端肽 此法还应用于嗜盐菌的 N 端肽分析 26 N 端肽的化学修饰除了便于其检测 还被尝试用于蛋 白质的相对定量研究 如通过合成磺苯基异硫氰酸 SPTIC 的稳定同位素类试剂 13C SPITC 与常规的 12C SPITC 试 剂一起进行蛋白质标记 不仅有利于肽段从头测序 而且无 论使用 MALDI TOF TOF 还是 RPLC ESI MS MS 对标准 蛋白的相对定量都得到了理想的效果 27 28 Hsu 等 29 利用 对 N 端肽的双甲基化标记 大大提高了衍生肽段在二级质 谱中的 a1 离子信号 他们将这种在非衍生化肽段中很难被 检测到的 a1 离子作为 N 端氨基酸的质量标签 增加了肽 段从头测序和数据库检索的可靠性 并以血红蛋白为例考查 了用于蛋白质相对定量的可行性 30 目前上述方法大多还处在在简单体系中探索的阶段 只 有少数已应用于蛋白质组的 N 端分析 操作也很繁琐 N 末端天然封闭的蛋白质测序的方法还需要进一步改进 2 2 3 N 端封闭蛋白质的端肽研究方法 蛋白质的 N 端 常常发生甲基化 乙酰化 焦谷氨酸环化等各种修饰 31 各种修饰使得 N 端被封闭 无法进行直接的 Edman 降解 测序 也无法结合化学修饰进行质谱鉴定 且去除 N 端封 闭基团的方法都不具普遍适用性 如何将这种封闭的 N 端肽从大量自由 N 端肽段中分 离出来 降低肽段混合物的复杂程度 提高 N 端肽质谱鉴 定的机会 对蛋白质末端信息的获得和分析十分重要 Gorman 等 32 最早提出使用离子交换色谱 利用封闭 N 端 肽与中间肽段的碱性不同 分离鉴定了病毒蛋白质的 N 端 肽 Dormeyer 等 33 报道了一种迭代数据库搜索策略 对来 自人胚胎癌细胞粗膜的肽段的强阳离子交换色谱 SCX 馏 分进行末端肽的目标分析发现 鉴定到的非冗余 N 乙酰化 肽段中 超过 80 在 10 min 内被低盐流动相从 SCX 色 谱柱上洗脱 表明 SCX 技术在一定程度上可用于蛋白质 N 端肽的分离 最近 Coussot 等 34 使用金属内切蛋白酶 Lys N 利用 异硫氰酸苯酯修饰的玻璃珠共价结合中间肽 实现了碳酸酐 酶封闭 N 端肽的分离和 MALDI TOF MS 鉴定 这种反应 有较好的特异性 但所用金属内切酶 Lys N 的酶切作用过 于温和 一些位点可能不会被切开 不利于 MALDI MS 的 检测 Toshiyuki 等 35 最近也报道了用异氰酸基团来修饰 树脂 通过控制弱酸性反应条件去除胰蛋白酶酶切后所有 自由氨基端的肽段 很好地实现了封闭 N 端肽的分离及 MALDI MS 鉴定 这些新方法通过去除自由 N 端肽段 减少了体系的复杂程度 对 N 端肽的鉴定有着潜在的应用 价值 3 结语 综上所述 蛋白质和多肽的 N 端序列分析 随着经典 方法 基于质谱的各种化学修饰以及酶法辅助技术不断地发 展和完善 获得了丰富的末端肽序列信息 为蛋白质的准确 鉴定提供了有力的依据 并加深了我们对蛋白质的结构和功 能的理解 但目前现有的数据库仅提供了少量甚至不准确的 蛋白质 N 端信息 36 而复杂生物体系中成千上万种蛋白质 的 N 端测序分析技术仍然是我们面临的巨大挑战 尤其是 对 N 端的修饰多样性大规模地进行更详细的判定 还需要 更有针对性的研究策略 今后的发展方向可能在选择性更 好 修饰更可控的化学修饰试剂及修饰条件的探索 以及一 些技术方法的交叉 整合和互补 以建立适用范围广 简便 快速的序列分析方法 增进研究技术的效率为目的 特别是 提高其灵敏度和自动化程度 参考文献 1 Wilkins MR Gasteiger E Tonella L et al Protein identification with N and C terminal sequence tags in proteome projects J Mol Biol 1998 278 3 599 608 2 Yang JZ Chen W Borchardt RT In vitro stability and in vivo pharmacokinetic studies of a model opioid peptide H Tyr D Ala Gly Phe D Leu OH DADLE and its cyclic prodrugs J Pharmacol Exp Ther 2002 303 2 840 848 3 Marsch tz MK Zallner W Mattner F et a1 Improvement of the enzymatic stability of a cytotoxic T lymphocyte epitope model peptide for its oral administration Peptides 2002 23 10 1727 1733 4 Bachmair A Finley D Varshavsky A In vivo half life of a protein is a function of its amino terminal residue Science 1986 234 4773 179 186 5 Emanuelsson O Brunak S von Heijne G et al Locating proteins in the cell using TargetP SignalP and related tools Nat Protoc 2007 2 4 953 971 6 Giglione C Boularot A Meinnel T Protein N terminal methionine 216 中国医药生物技术 2008 年 6 月第 3 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol June 2008 Vol 3 No 3 excision Cell Mol Life Sci 2004 61 12 1455 1474 7 Walia H Chen HY Sun JM et al Histone acetylation is required to maintain the unfolded nucleosome structure associated with transcribing DNA J Biol Chem 1998 273 23 14516 14522 8 Bodai L Pallos J Thompson LM et al Altered protein acetylation in polyglutamine diseases Curr Med Chem 2003 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