RNA干扰(RNAi).doc

RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默1 。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。 RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象 发现：RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。1998年，安德鲁法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果1。从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。2006年，安德鲁法厄与克雷格梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。siRNARNA干扰现象的机理RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为2123nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成2123nt及3端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。 迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶（RNA helicase）也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1，这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA（或siRNA）作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异RNAi的作用机理： 目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymerase）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解 另一方面结合的产物以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。siRNA还能够通过某种不太明了的机制永久地关闭或者删除DNA片断，以在非常大的程度上控制染色质的形成，而不是仅仅暂时地抑制它们的活动。 动植物和人体的病原体中有一些是RNA病毒，如导致艾滋病的HIV和SARS的冠状病毒都是RNA病毒。有些RNA病毒在复制过程的一定阶段中会产生双链RNA。如果宿主体内有分解这种双链RNA的酶，就可将双链RNA切割成许多小的片段，这种小片段会与病毒RNA基因组的同源部分结合，使病毒基因失去复制功能，也就不能危害宿主。所以RNAi是自然界生物长期进化形成的一种防御机制。RNAi的现状与未来疾病治疗 用RNAi来制备药物。其思路是根据病原体如病毒、细菌等的致病基因序列，以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列有同源序列的双链RNA，转入动植物内使有关的疾病基因“沉默”(不能表达功能)，从而达到治疗的效果。以治疗HIV为例，理论过程如上图所示。原理是利用siRNA抑制病毒再生或传染所需的蛋白质的生成。它的优势在于能够不损伤细胞而只抑制病毒蛋白质，其专一性是其他药物所难以具备的。但问题在于目标基因的选择，即如何筛选出针对致病蛋白质而不影响细胞正常的新陈代谢的siRNA。而且艾滋病毒变化迅速，目标 RNA 序列有可能在短时间内失效，这都给筛选提出了巨大的挑战。 对其他病毒的治疗也存在类似的问题，如SARS等。目前研究大都处于初期阶段，只在离体细胞或简单的真核细胞上做过试验，况且哺乳动物与人体的RNAi机制尚未清晰，所以利用siRNA制备药物潜力巨大但前路漫漫。生物进化 在许多真核生物中都发现了RNAi现象，而在原核生物中却未发现，提示了RNAi的进化地位，但是其在进化中是如何出现的，如何保存下来的，在生物体中的意义有多大，目前均没有分析清楚，还需要更多的研究来阐明。siRNA的出现重新唤起了科学家们对“RNA世界”的重视及对“生命起源于RNA分子”这一命题的兴趣。有的科学家认为成千上万非编码蛋白质的RNA分子组成了巨大的分子网络调节着细胞中的生命活动，它们与蛋白质-蛋白质相互作用网络相对应，将为基因组和生命科学研究提供无比美好的前景。干细胞与细胞分化 很容易联想，siRNA与细胞分化必然有着极其重要的联系，即有可能参与了细胞周期调控机制。 研究者发现，RNAi在Epigenetics中发挥重要作用。Epigenetics是指：至少一代的基因表达改变，而基因的编码不变。epigenetics调控的一种类型是染色体的改变。通过改变染色体的形状（更紧或是更松），来决定哪一个基因表达。siRNA在染色体形状的改变中起着非常重要的作用。 RNAi已被证实能引导植物干细胞的分化，因而研究者认为RNAi也可能参与指导人的干细胞的分化。由于RNAi在基因表达调控中发挥重要的作用，对RNAi微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。干细胞和肿瘤细胞都有共同的特性，例如可塑性和自身更新的特性。这说明它们可能有类似的细胞内分子机器。一些研究者把针对P53抑癌基因的双链RNA引入胚胎干细胞，使得干细胞中的P53基因受抑，最终使干细胞发育成肿瘤细胞。一个有趣的现象是，P53受抑制的程度与干细胞发育成肿瘤细胞的进程、恶性程度成正相关，若P53受抑程度小，变成肿瘤的速度就慢，且恶性低。RNAi的问题与猜想问题： 在siRNA与RNAi的研究中，仍有许多的问题：蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式？对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。哺乳动物与人的RNAi机制是否与简单的真核生物类似，RNAi的进化地位如何等。猜想1、 疾病治疗：主要的问题还是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。依靠免疫系统寻找转运载体可能成为途径之一，而免疫系统中本身可能也有RNAi参与。细胞中是否普遍存在RNAi或进行RNAi的潜力呢？细胞的凋亡机制可能也与RNAi有关。病毒的蛋白质复制途径可能有多种，RNAi是否能像人们期待的那么有效？2、 如果siRNA可以永久地关闭或者删除DNA片断，而不仅仅是短期的抑制它。那么动物细胞全能性受抑制的程度可能远远高于过去人们所想象的。干细胞的可塑性可能是由于可以产生特异的siRNA或其前体。干细胞通过细胞内的RN