5-aza-dc论文.doc

5-aza-dc对延边奶山羊耳成纤维细胞生物特性的影响蔡丽娟，尹 多，庄利利，方南洙，李钟淑*、（延边大学 农学院 动物遗传育种与繁殖实验室，延吉，133002）摘 要：（目的）探讨DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dc对延边奶山羊耳成纤维细胞形态、活率以及染色体的影响，以获得不影响细胞正常生物学特性的最适条件。（方法）5-aza-dc对供体细胞进行不同处理后，利用MTT选定5-aza-dc的最适作用浓度和时间，应用PI、Hochest33342双染和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况，通过核型分析检测5-aza-dc对细胞染色体的影响。（结果）结果表明，低浓度的5-aza-dc（0.01mol/L）作用72h对细胞影响不大；随其浓度的增加，细胞形态、活率、凋亡及染色体都受到显著影响。（结论）5-aza-dc对细胞的最佳处理时间为72h，此时低浓度的5-aza-dc并未引起细胞凋亡、核型发生改变。关键词：5-aza-dc；延边奶山羊耳成纤维细胞；细胞活率；细胞形态；细胞凋亡；染色体中图分类号：S827 文献标识码：A 文章编号：Effect of the cell biological characteristics of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cellCAI Li-Juan, YIN Duo, ZHUANG Li-Li, FNAG Nan-Zhu, LI Zhong-Shu*(Animal genetic breeding lab, YanBian University, YanJi, China, 133002)Abstract: (Objective) Discuss the effect of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on cell morphology, viability chromosomal of Yanbian dairy goat ear fibroblast cells . Then attempt to obtain an optimal conditions that does not affect the normal cell biological characteristics. (Method) After different treatments of donor cells with 5-aza-dc, used MTT to select the most suitable treatment concentration and time, PI and Hochest33342 double staining, agarose gel electrophoresis experiment were used to detect apoptosis of the cells, applied karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes . (Result) The results showed， low concentrations (0.01 mol/L ) of 5-aza-dC with 72 h had little impact on the cells; With the increasing of concentration, cell morphology, viability, apoptosis and chromosomes were significantly affected . (Conclusion) The best processing time of 5-aza-dc was 72h. low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and the change of karyotype. Key words: 5-aza-dc; Yanbian dairy goat ear fibroblast cell; cell morphology; cell viability; cell apoptosis; chromosomal收稿日期：基金项目：吉林省科技厅重点项目 人血清白蛋白转基因延边奶山羊新品系培育（20100228）作者简介：蔡丽娟(1986-)，女，吉林省大安市人，硕士研究生，主要从动物遗传育种的研究。Email: ；Tel通讯作者：李钟淑，教授，E-mail , Tel细胞核移植，是哺乳动物胚胎工程的主要组成部分，也一直是研究的热点。然而核移植研究中仍然存在这许多问题，如核移植效率低、胚胎发育异常、流产、畸形等。大量研究表明，体细胞核移植所用的供体细胞（成纤维细胞、颗粒细胞等）都是高度分化的细胞，具有较高的甲基化水平，在与受体细胞融合时需要经过充分的去甲基化才能维持胚胎正常发育，如果重构胚基因组DNA的甲基化模式存在异常，可引起特定基因转录模式发生改变，从而导致重构胚发育异常。因此，有必要寻找一种降低DNA甲基化水平，进而改善核移植效率的方法。5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-dc）是一种DNA甲基化酶抑制剂，为正常胞嘧啶核苷的类似物。在细胞内，它可以转化为脱氧核苷三磷酸，并在DNA复制的过程中替代正常的胞嘧啶核苷酸参与到延伸的DNA链中。进入DNA双链后，它们所含有的修饰碱基5-氮胞嘧啶可以与DNA甲基转移酶共价结合，使酶的活性降低，最终使处理细胞基因组DNA发生去甲基化；有研究表明DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理牛供体细胞，能有效降低其甲基化水平1-2。舒金辉3利用5-氮-2-脱氧胞苷(0.005-0.09M)处理水牛成纤维细胞，显著的降低了供体细胞的甲基化水平并提高了随后核移植的效率。延边奶山羊耳成纤维细胞作为延边奶山羊体细胞克隆的核供体有重要的研究意义。因此，本研究旨在探讨5-aza-dc对延边奶山羊体细胞克隆供体细胞的影响，为提高延边奶山羊体细胞克隆效率提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料与试剂1.1.1试验材料 延边奶山羊耳部组织块。剪取奶山羊(母)耳部血管较少处组织，大约1.52.0cm2。用PBS冲洗1次，75%酒精浸泡30s，再用PBS冲洗3次，最后将组织块剪碎。经过3-5次PBS及胰酶洗涤后，均匀接种于25cm2培养瓶中，5小时后加含15% 胎牛血清的DMEM培养液4。每3-5天换液一次。当原代细胞汇合至80%时，消化传代，3代以后的成纤维细胞可用于试验。1.1.2 试验试剂 DMEM， EDTA，DMSO、5-aza-dc（DMSO预融，超纯水配制成0.25mg/ml的浓缩液备用），PI，Hochest33342、MTT，Giemsa染液，胰蛋白酶，胎牛血清（杭州四季青），其他基础药类等，无特殊说明均购自SIGMA公司。DNA提取试剂盒（大连宝生物）。1.2 试验方法1.2.1 5-aza-dc处理延边奶山羊耳成纤维细胞取3代以上的延边奶山羊耳成纤维细胞，消化传代，调整细胞密度为105，接种于24孔或96孔培养板，待细胞处于对数生长期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培养液分别培养。5-aza-dc浓度设定为0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L。1.2.2 5-aza-dc对细胞活率的影响不同浓度（0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L）的5-aza-dc处理成纤维细胞96h、72h、48h、24h后，96孔板每孔添加5mgml MTT 10l，作用4h后，吸出培养液，每孔添加150l DMSO，振荡10 min，酶联反应仪测492nm处的OD值。MTT、DMSO均具有毒性，注意试验过程中做好防护措施。且MTT需要避光试验。1.2.3 5-aza-dc对细胞形态的影响不同浓度（0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L）的5-aza-dc处理成纤维细胞72h后，显微镜下观察细胞形态。1.2.4 5-aza-dc对细胞染色体的影响不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72h后，换液，每孔添加50l秋水仙素，2.5-3h后，消化悬浮细胞，1000r 离心10min，37预温的0.075 mol/L KCL低渗处理30min后，用新鲜固定液（甲醛：冰醋酸=9：3.5）固定细胞两次，最后用0.5-1ml固定液悬浮细胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油镜观察5。每组处理选取一定数量的清晰分裂相，记录变异的染色体数目。1.2.5 5-aza-dc对细胞凋亡的影响 Hochest33342/PI双染法荧光显色法检测细胞凋亡不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72h后，消化悬浮细胞，调整细胞密度为106，加入5g/ml的Hochest33342荧光染色，37避光孵育 10min，离心去上清，用培养液悬浮，加入5g/ml 的PI染色液，4冰箱孵育15 min，荧光显微镜下观察6。 琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72h后，消化收集细胞于1.5ml离心管中，5000转离心5min，500l PBS悬浮细胞后，按DNA提取试剂盒步骤提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪观察并照相。1.3 数据分析试验所得结果使用SPSS17.0进行分析，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）的方法检验数据差异性，当P0.05时认为存在显著差异。2结果与分析2.1 5-aza-dc对细胞活率的影响如下表1所示，不同浓度的5-Aza-dc分别培养延边奶山羊耳成纤维细胞24、48、72、96h后的细胞活率，比较可知72h组效果较好，且与48h、96h组差异不显著，所以后续试验中细胞均处理72h。表1 5-Aza-dc处理不同时间对细胞活率的影响Table 1 Effect of the cell survival rate by different treatment time of 5-Aza-dc浓度时间Concentrationtime24 h48 h72 h96 h0.0000.0950.0087a0.0870.0008a0.1100.0324a0.1240.0251a0.0050.1080.0257a0.1260.0025a0.1270.0085a0.1270.0260a0.0100.1040.0195a0.1240.0085a0.1300.0167a0.1640.0193b0.0300.1040.0111a0.1340.0045b 0.1430.0046bc0.1590.0252c0.0500.0990.0117a0.1330.0015b 0.1430.0046bc0.1630.0292c0.1000.0950.0040a0.1330.0025b0.1210.0072b0.1630.0144c注：同行数据后所标字母相异表示差异显著（P 0.05）。Note: Different letters in the same row means significant difference between the treatments（P0.05）.2.2 5-aza-dc对细胞形态的影响未经5-aza-dc处理的细胞生长状态良好，接触紧密，细胞大小均一，生长速度较快。而经过5-aza-dc处理后的细胞随着5-aza-dc浓度的升高，细胞变得细长，生长缓慢，细胞间隙增大，形态不规则，甚至有的地方细胞大片脱壁死亡。如下图所示:图1 不同浓度5-aza-dc处理的延边奶山羊成纤维细胞，1-6 分别代表0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L（40）Fig.1 Different concentration of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cell, 1-6 are 0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L（40）2.3 5-aza-dc对细胞染色体的影响采用常规核型分析方法，分析不同浓度的5-aza-dc处理的延边奶山羊耳成纤维细胞，每个处理组选取50个分散较好的清晰分裂相，统计畸变染色体概率。结果如下图：当浓度0.01mol/L时，染色体畸变率对照组与其他两组差异不显著；当浓度0.03mol/L时染色体畸变率显著增加，出现多倍体，如图3。当浓度达到0.1mol/L时，染色体畸变率达到12%。图2 不同浓度5-aza-dc对染色体的影响，不同字母表示差异显著(P0.05)Fig.2 The effects of chromosome with different concentration of 5-aza-dc, different letters means significant difference between the treatments（P0.05）, 图3 经不同浓度的5-aza-dc处理的染色体组型Fig. 3 The chromosome karyotypes of treated with different concentrations of 5-aza-dc2.4 5-aza-dc对细胞凋亡的影响2.4.1 Hochest33342/PI双染法荧光显色法检测细胞凋亡PI-Hochest33342双染色后，在荧光显微镜下可见凋亡细胞呈强蓝色、弱红色荧光，坏死细胞呈强红色，而正常的细胞则呈弱蓝色荧光。当浓度为0mol/L、0.005mol/L和0.01mol/L时，凋亡细胞较少；浓度0.03mol/L时出现较多凋亡细胞；浓度为0.1mol/L时，细胞凋亡增加，死细胞数目也增多。如图4所示。图4 Hoehes63342和pl双染色荧光图（0.03mol/L和0.1mol/L）Fig.4 The Hoehes63342 and PL double staining fluorescent image2.4.2 琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡如下琼脂糖凝胶电泳图谱所示，当浓度0.01mol/L时，细胞无拖带现象，说明无凋亡细胞；浓度0.03mol/L时，开始出现拖带现象，说明出现凋亡细胞；浓度为0.05mol/L 和0.1mol/L时，细胞大量凋亡，拖带现象明显。图5 5-aza-dc处理72h的成纤维细胞DNA凝胶电泳图Fig.5 Gel electrophoresis map of fibroblast DNA with 5-aza-dc in 72h3讨论3.1 5-aza-dc对细胞活率、细胞形态的影响5-aza-dc是一种典型的DNA甲基化抑制剂，为胞嘧啶的类似物。Kumar等利用0、0.5、1.0、2.0、3.0mol/L的5-氮杂胞苷处理第五代猪胎儿成纤维细胞(PFF)，发现不同浓度的5-azaC均抑制PFF的生长，较高浓度的5-azaC处理会导致细胞的形态和染色体的倍性发生改变(Kumar et al.，2006)7。Enright BP等对供体成纤维细胞进行5-aza-dc处理后发现高剂量5-aza-dc(0.08-0.31mol/L)可以降低细胞甲基化水平，其研究也发现5-aza-dc处理72h是最佳处理时间8，其他实验研究也证明了这点(舒金辉，2007;)3。鉴于5-aza-dc对细胞的毒性作用，本试验采用较低浓度的5-Aza-dc (0.005mol/L-0.1mol/L)处理延边奶山羊耳成纤维细胞。试验结果表明：经5-aza-dc处理后的细胞生长速度、形态等与对照组相比无明显差异，说明延边奶山羊耳成纤维细胞对5-aza-dc具有较强的耐受性。但是随着处理时间的延长，细胞形态改变、死亡数增多，逐渐出现脱壁等现象，这可能是与5-aza-dc对细胞的毒性有关。这与Kumar等的实验结果相似。3.2 5-aza-dc对细胞染色体的影响有研究证明，供体细胞的培养环境以及药物等处理会导致其染色体异常，进而引起随后NT胚胎染色体异常，说明在核移植前首先检查供体细胞的染色体还是必要的9。本实验使用常规染色体核型分析方法，即经低渗、固定、Giemsa染色等步骤后，滴片制备染色体标本。结果表明，高浓度的5-aza-dc对细胞染色体有致畸作用，浓度越高染色体出现异常的几率越大；而低浓度（0.01mol/L）对染色体影响不大。通过琼脂糖凝胶电泳实验进一步验证高浓度的5-aza-dc对染色体的影响，可见明显的拖带现象，分析原因可能是染色体结构发生改变，如断裂等。3.3 5-aza-dc对对细胞凋亡的影响PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst33342则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。本研究用5-aza-dc处理延边奶山羊耳成纤维细胞72h后，观察不同的浓度对细胞凋亡的影响，采用Hochest33342和PI双染色法检测细胞凋亡，在荧光显微镜下可见凋亡细胞呈强蓝色、弱红色荧光，坏死细胞呈强红色，而正常的细胞则呈弱蓝色荧光。正常细胞和中早期凋亡细胞均可被Hoechst33342着色，但是正常细胞核的Hoechst33342着色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒;而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状。细胞凋亡最明显的生化特征是Ca十、Mg十依赖的内源性核酸酶的激活，细胞核染色体从核小体间断裂成180-200bp的寡核苷酸片段。针对这些片应用琼脂糖凝胶电泳技术。凋亡细胞呈明显的梯状条带(DNA ladders)。本研究通过琼脂糖凝胶电泳结果可见，0.005mol/L -0.01mol/L几组都没有出现明显的拖带现象，而从0.03mol/L组就开始有拖带现象，0.05mol/L 和0.1mol/L浓度组与对照组相比细胞发生凋亡的比例显著增加。此结果进一步证明高浓度的5-aza-de可以导致细胞凋亡。结论 5-aza-dc处理延边奶山羊成纤维细胞适宜时间为72h，随着5-aza-dc处理浓度的升高，细胞形态有所改变，接触不紧密。当浓度升高到0.1mol/L时大片细胞脱壁死亡；当浓度0.03mol/L时，染色体畸变率显著增加，0.005mol/L和0.01mol/L组对染色体核型的影响与对照组相比差异不显著；琼脂糖凝胶电泳法检测经5-aza-dc处理的细胞凋亡情况，结果表明高浓度的5-aza-dc可以导致细胞凋亡，低浓度的5-aza-dc对细胞凋亡的影响较小。以上说明高浓度的5-aza-dc对细胞有一定毒性作用，但是低浓度对细胞影响较小，可以应用低浓度的5-aza-dc作为DNA甲基化酶抑制剂处理供体成纤维细胞，尝试建立