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实验四 免疫学实验 一、机体体液免疫功能测定（一）凝集反应【目的】了解玻片凝集试验、试管凝集试验及胶乳间接凝集抑制试验的操作过程、结果分析和实际应用。【原理】颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体在一定电解质存在的条件下发生特异性结合并出现肉眼可见的凝集块的现象称为凝集反应。凝集反应既可用已知抗体检查和鉴定未知的抗原(如鉴定细菌)，也可用已知抗原检查血清中相应的抗体；既可用作定性检测，又可用于定量检测。凝集反应分两种。一种是颗粒性抗原与抗体直接结合出现的凝集现象，称为直接凝集反应；另一种是将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的载休颗粒表面，再与相应的抗体结合而出现的凝集反应，称为间接凝集反应。如将抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的抗原结合而出现的凝集反应则称为反向间接凝集反应。 1、玻片凝集反应【材料】伤寒诊断血清、伤寒沙门菌及大肠埃希菌培养物、载玻片、生理盐水等。【方法】 生理盐水伤寒诊断血清伤寒诊断血清伤寒沙门菌伤寒沙门菌大肠埃希菌 左 中 右取载玻片1张，左侧加生理盐水1滴，中间及右侧各加伤寒诊断血清1滴；用接种环取伤寒沙门菌培养物少许，分别与盐水及中间的伤寒诊断血清混匀。同法取大肠埃希菌培养物与右侧伤寒诊断血清混匀；轻轻摇动玻片12min后，观察结果；观察后，将玻片直接投入消毒缸，不要冲洗，以防污染。【结果 】 出现凝集物者为阳性反应，均匀混浊无凝集物者为阴性反应。【注意事项】玻片凝集反应用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，不可有杂菌污染以及前一试剂残留。用接种环取细菌时应先烧灼灭菌，待冷却后方可挑取细菌。用接种环加细菌于血清中后，应先烧灼接种环，再取细菌加入另一血清中。【结果分析】左： 中： 右： 应用： 2、试管凝集反应试管凝集反应为半定量试验，常用已知抗原检测患者血清中相应抗体的效价。【材料】伤寒诊断血清(抗体)、伤寒菌液(抗原)、生理盐水(NS)、刻度吸管、试管等。【方法及结果】见表试管凝集反应的方法试管 1 2 3 4 5 6 7生理盐水(ml) 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃去0.5 0.5伤寒诊断血清(ml) 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 . 0.5 NS 0.5血清稀释倍数 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 对照菌液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5血清最终稀释倍数 . 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 对照 56 4小时,4冰箱过夜,次日观察结果结 果效 价【结果判断】见表手持试管，对光观察管内液体混浊度及管底沉淀物之性状。试管凝集反应结果的判读记录符号 上层液体 管底凝集物 + 完全澄清 凝块多而明显，全部沉于管底+ 微混浊 凝块显著，大部分沉于管底+ 稍混浊 凝块较明显，中等沉于管底+ 混浊 凝块不太明显，少许沉于管底- 混浊 细菌均沉积于管底，呈小园点状，不见凝块凝集效价的判定：呈“+”阳性反应的最高稀释倍数为该血清的效价(也称滴度)。对照管(第7管)应为阴性。【注意事项】 观察结果时，先看生理盐水对照管，可见管底有圆点状细菌沉积，边缘整齐，轻摇则分散为混浊的菌液，似烟雾状。【思考题】试管凝集反应的临床应用： （二）沉淀反应可溶性抗原(如血清、细菌浸出液、毒素等)和相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，经一定时间，二者在比例适当时形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参与反应的抗原称为沉淀原，而相应的抗体称为沉淀素。由于沉淀反应的抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，为获得抗原与抗体的适宜比例，操作中通常稀释抗原而不稀释抗体，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。本实验介绍琼脂扩散试验和对流免疫电泳。【目的】了解单扩、双扩及对流免疫电流的原理、操作步骤及临床应用。1、单向琼脂扩散试验：【原理】琼脂属于大分子多糖，100时熔化，低于45时凝固而形成网状结构，并能允许抗原抗体的在其中自由扩散。琼脂扩散试验是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂内扩散，若二者对应且比例合适，则出现白色沉淀物。单向琼脂扩散试验系定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中将定量的抗体混合于琼脂内倾注于玻片上制成琼脂板，凝固后打孔。再将待检抗原加入孔中，因抗体与琼脂混合凝固后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周扩散，抗原、抗体在比例适合处可形成白色沉淀环。由于只有抗原扩散故称之为单向扩散。沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环的直径作纵座标，以抗原浓度为横座标，绘制标准曲线。测量待检抗原的沉淀环直径，从标准曲线中求得其含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白或血清补体含量。目前也常采用血清全自动分析仪检测各种免疫球蛋白或血清补体含量。【材料】人免疫球蛋白IgG的诊断血清(冻干羊抗人IgG即抗体)。人免疫球蛋白标准血清（抗原），待检人血清（抗原）。打孔器、加样器、37恒温箱、1.8琼脂玻片等。【方法】制板：按抗血清效价的一半，用56预热的生理盐水稀释抗血清，再加入等量的冷却至56的琼脂轻轻混匀，灌板(3ml/板)。打孔：以打孔器打孔，孔径3mm，孔距1cm，每板2排，每排5个孔，用针头把孔内琼脂块挑出。按说明书要求稀释标准血清与待检血清。待检血清1：50稀释，标准血清系列稀释至：1:12.5，1:25，1:50，1:100，1:200。加样：用微量加样器在第1排孔中依次加入不同稀释度的人标准血清各10l，第二排相邻两孔中加待检血清各10l。将琼脂板放入湿盒，3724h后测各沉淀环直径。单扩标准孔示意图 单扩标准曲线示意图以沉淀环直径为纵座标，相应孔的IgG含量为横座标，在半对数纸上制作标准曲线。根据 待检血清沉淀环直径查标准曲线，将查得的IgG含量乘以标本的稀释倍数即为待检血清中的IgG含量。【注意事项】 灌板时，一定要将抗血清56预温(但不要超过56，否则会破坏抗血清)，再与冷却至56的琼脂混匀，迅速灌板(所灌板应厚薄一致，无气泡)。加样要准确、均一，打孔时孔距不能小于1cm。【结果观察记录】绘图。 含羊抗人IgG琼脂待检血清 单扩实验结果【临床应用】： 2、双向琼脂扩散试验 【原理】双向琼脂扩散试验为定性试验。将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，两者相互扩散，在比例适宜处形成沉淀线。如抗原与抗体无关则无沉淀线出现。本试验常用于分析抗原抗体的纯度与相互关系。临床上曾经用于检测甲胎蛋白(AFP)，作为原发性肝癌的辅助诊断。【材料】甲胎蛋白免疫血清。脐带血血清，待检血清。玻片、琼脂、打孔器、加样器等。双向琼脂扩散【方法】制板：将已熔化的1.8盐水琼脂倒在玻片上，3ml/板。打孔：用打孔器照图1-8打孔。加样：中央孔加甲胎蛋白免疫血清，1和4孔加脐带血血清，其它孔内加待检血清，每孔均加10l（。将琼脂板置于湿盒内，37 24h后观察结果。【结果及绘图】待检标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线相吻合，则为阳性反应。如无沉淀线出现或与阳性对照沉淀线完全交叉则为阴性反应。双扩沉淀线类型表示两种抗原完全相同；表示两种抗原完全不同；表示两种抗原部分相同【注意事项】加样时注意不要划破琼脂，以免影响沉淀线形状。反应时间要适宜。时间过长，沉淀线可解离致假阴性；时间过短，则沉淀线不出现。加样时，抗体、阳性血清及待检标本应各用一支加样器，以免混淆，影响实验结果。 沉淀线出现的位置及沉淀线是否弯曲均有不同意义，应注意分析。【结果分析】： （三）补体溶血试验【目的】了解补体溶血试验的原理、方法和应用。【原理】补体是具有酶活性的一组球蛋白，不耐热，56 30min即被破坏。其作用没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。实验室常用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源。当用红细胞免疫动物后，动物免疫血清中即含有特异性抗体(溶血素)，若红细胞与相应抗体结合而有补体存在时，则红细胞被溶解，此为溶血反应。本反应通常作为补体结合反应的指示系统。临床上如发生输血错误，也可出现溶血反应。【材料】溶血素(抗体)、2绵羊红细胞悬液(抗原)、补体。生理盐水、小试管、吸管、37水浴箱。【方法】取小试管5支，分别注明管号，按表1-4依次将各成分加入前4支试管中。 溶血反应加样程序1（ml） 试管号12342绵羊红细胞0.50.50.5 0.5溶血素(2个单位) . 0.5 0.5 - -补体(2个实用单位) . 0.5 - 0.5 -生理盐水 . . 0.5 1.0 1.0 1.5混匀试管内容物，将4支试管置37水浴1530min，观察有无溶血现象，若红细胞溶解，则由红色的细胞混浊液变为红色透明液体。将不溶血试管的第2、3管低速离心35min，使红细胞沉淀，用滴管将上清液与沉淀物分开（第1管出现溶血，第4管不溶血）。将第2管上清液用毛细管吸入第4管，将第3管上清液倒入第5管，然后再按表加入各物。混匀后，将上述第2、3、4、5号试管置37水浴1530min后，观察结果。溶血反应加样程序2（ml）试管号234 5内容物第2管沉淀物第2管沉淀物第2管上清液第2管上清液2绵羊红细胞- - 0.5 0.5溶血素(2个单位) . - 0.5 - 0.5补体(2个实用单位) . 0.5 - 0.5 -生理盐水 2.5 2.5 - 2.0结果 溶血不溶血不溶血溶血【结果】第2、5号试管出现溶血，第3、4号试管不出现溶血。【分析】试管1： 试管2： 试管3： 试管4： 试管5：【思考题】补体有何生物学功能，本实验揭示其何种功能?二、机体细胞免疫功能测定【目的】了解E玫瑰花结试验、淋转试验的原理、方法、结果观察及意义。（一）E玫瑰花结试验(总T-花结形成试验)【原理】人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，在体外一定条件下，当T细胞与SRBC混合时，可形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花结。E花结的形成是T细胞独特的标志。E花结形成试验最常用的是总E花结试验和活性E花结试验。总E花结试验代表被检标本T淋巴细胞的总数和百分率；而活性E花结试验反映的是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，该亚群T细胞与T细胞的体内外功能活性有密切关系，在一定程度上反映机体细胞免疫功能。【结果观察】 绘图(E玫瑰花结形成细胞)。（二）淋巴细胞转化试验【原理】T淋巴细胞在PHA的刺激下可转化为淋巴母细胞，转化过程中的物质基础是淋巴细胞核DNA的合成，DNA特有的组成成分是胸腺嘧啶核苷，人工将胸腺嘧啶核苷用同位素3H-TdR标记，通过计数淋巴细胞内的放射性就可推知淋巴细胞的转化程度。【结果观察】用形态学检查转化的淋巴母细胞形态特征： 母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的34倍(成熟的淋巴细胞直径约610m)。核膜清晰，核染色质疏松呈细网状。核内可见明显的核仁3个。胞浆丰富嗜碱性，有伪足样突出，胞浆内有时可见小空泡；过渡型淋巴母细胞：核质疏松，可见核仁胞浆增多，嗜碱性强，体积比小淋巴细胞大； 核分裂相细胞：核呈有丝分裂(核膜消失)可见许多成堆或散在的染色体。转化的淋巴细胞+未转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化率100%结果判定绘图(淋巴母细胞)。 E-玫瑰花结形成细胞 淋巴母细胞【思考题】E花结试验和淋转试验各有何临床意义?三、免疫标记技术免疫标记技术是利用酶、荧光素、放射性同位素、胶体金或非放射性物质如光敏生物素等，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。【目的】了解ELISA、免疫荧光技术、RIA及胶体金技术的原理、操作方法、结果观察和实际应用。（一）酶免疫技术酶免疫技术（EIA）是一种把抗原抗体反应的特异性和酶的专一高效催化底物的能力二者相互结合而设计的一种血清学方法。此法是通过化学方法将酶与抗原或抗体结合，形成酶标记物。这种酶标记物仍保持其免疫活性和酶活性。然后将它们与相应的抗体或抗原发生反应。当已形成的酶标记免疫复合物遇到相应酶底物时，可催化其水解、氧化还原等反应，生成有色产物。酶降解底物的量与呈现的色泽浓度成正比，由此反映被测定的抗原或抗体的含量。若生成的为可溶性产物，可用肉眼或比色法定性或定量测定；若生成的产物为不溶性沉淀物，则可用光学显微镜进行抗原或抗体的定位研究。【原理】酶免疫技术既可应用于组织、细胞内抗原检查和定位，又可用于测定可溶性抗原或抗体，后者称为酶联免疫吸附试验。酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原或抗体吸附于固相载体，使免疫反应在载体上进行，然后借助特异性结合的标记抗体显示酶活性，通过测定酶催化底物所得的产物来判断抗原或抗体的量。应用较广的有间接法和夹心法。ELISA的原理见下图。【ELISA的临床应用】测定抗原。应用较多，如微生物及其产物(霍乱肠毒素、白色念球菌抗原、HBsAg等)。根据标准曲线可定量测定IgE、AFP、激素等。测定抗体。用于传染病、寄生虫病、病毒性疾病、立克次体病等抗体的测定。用于病毒筛选及自身免疫病的测定。测定细胞因子及其可溶性受体。 酶联免疫吸附试验原理1、ELISA双抗体夹心法测抗原【材料】兔抗人IgG(抗体)、酶标记抗人IgG单克隆抗体(酶标抗体)、人血清(抗原)。其它试剂 包被缓冲液(0.01mol pH9.6碳酸盐缓冲液)、标本稀释液(含0.05吐温-20、0.01mol pH7.2 PBS)、洗涤液(含0.05吐温-20、0.01mol pH7.2 PBS)、底物溶液(含0.04邻苯二胺、pH5.0柠檬酸缓冲液)、终止液(2mol H2S04)。聚苯乙烯酶标板、塑料洗瓶、微量移液器。【方法】已知抗体包被酶标板：用包被缓冲液将兔抗人IgG抗体稀释至工作浓度后，按每孔100l包被酶标板，4过夜。洗板：弃去酶标板内的包被抗体，在吸水纸上拍干，每个孔内加满洗涤液，静置23min，再在吸水纸上拍干，如此洗涤3次。加待检抗原标本：取不同稀释度的人血清标本，加于酶标板内，每孔100l，每份标本加2孔，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。置37湿盒30min。弃去酶标板内液体，按步骤2洗板3次。每孔加100l酶标记抗人IgG单克隆抗体，置37湿盒30min。弃去酶标板内液体，按步骤2洗板3次。每孔加底物溶液100l，37避光孵育15min。每孔加终止液一滴(约501)，终止反应。观察显色反应或用酶标仪在490nm处用水调零，测定其OD值。【结果判断】用酶标仪检测时，以空白孔调零，先测阴性对照OD值(N)，再测待检孔OD值(P)，当P/N2.1 时，判为阳性；15为可疑；P/N2.1时，判为阴性。P/N =标本OD值 空白对照OD值阴性对照OD值 空白对照OD值 肉眼判断：反应孔呈棕黄色为阳性结果，无色为阴性结果。肉眼判断时，待检孔颜色与阴性对照孔颜色相同或更浅判为阴性；若待检孔颜色明显加深，判为阳性：“-”为无色，“+”为浅黄色，“+”为黄色，“+”为棕黄色，一般呈“+”以上者为阳性。结果记录与分析： 2、ELISA间接法测抗体 【材料】 可溶性抗原：根据所测的蛋白浓度用pH9.6 0.01mol碳酸盐缓冲液稀释至1lOgml左右。 酶标记抗人IgG(酶标抗体)。 待检患者血清(抗原)。 其它试剂：包被缓冲液(0.01mol pH 9.6碳酸盐缓冲液)；标本稀释液(含1牛血清白蛋白、0.05吐温-20、0.01mol pH7.2 PBS)；洗涤液(含005吐温-20、0.01mol pH7.2 PBS)；底物溶液(含0.04邻苯二胺pH5.0柠檬酸缓冲液)；终止液(2mol H2S04)。聚苯乙烯酶标板、塑料洗瓶、微量移液器、吸水纸等。【方法】已知抗原包被酶标板：用包被缓冲液将已知可溶性抗原作适当稀释后，用微量移液器每孔加入1001，4过夜。洗板：弃去酶标板内的包被抗原，在吸水纸上拍干，孔内加满洗涤液，静置23min，再在吸水纸上拍干，如此洗涤3次。 加待检患者血清：将待检患者血清用稀释液作不同倍数稀释，如1：20、1：40、1：80、。洗板：同。加酶标记抗人IgG：用稀释液将酶标记抗人IgG稀释至工作浓度，每孔加100l，置37湿盒孵育2小时。洗板：同。 加底物溶液：每孔加临时配制的底物溶液100l，置37湿盒孵育20min。终止反应：每孔加终止液50l。【结果判断】 肉眼观察判断，滴度超过阴性血清对照的标本定为阳性。（二）免疫胶体金技术【原理】胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。常用的标记物包括抗体、毒素、SPA、PHA、ConA、激素、酶及蛋白质分子等。典型的测定方法有斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。胶体金技术具有简便、快速等优点。【临床应用】光学显微镜上的应用 用于免疫组织化学检测，将特异抗体与组织抗原先发生反应，再用金标记抗体进行染色(即间接法)，以确定抗原的分布，也可用金催化还原银离子的原理，结合摄影技术以银增强金标抗体的可见性，即免疫金银法(IGSS)。电子显微镜上的应用 利用金颗粒高电子密度，经衬染后的组织可对被检抗原或抗体进行组织或细胞的定位观察，作细胞学超微结构的免疫定量研究，也可结合铁蛋白进行双重或多重标记研究。荧光显微镜上的应用 将荧光素吸附于胶体金，在荧光显微镜下作定向性分布及定位观察免疫荧光标本，加强免疫荧光效果。斑点免疫层析试验(DICA)【原理】斑点免疫层析试验简称免疫层析试验(ICA)，它也以硝酸纤维膜为载体，将多个试剂组合在一个约6mm70mm的塑料板条上，成为单一试剂条(图1-12)，试剂条上端(A)和下端(B)分别为粘贴吸水材料，金标抗体干片粘贴在近下端(C)处，紧贴其上为硝酸纤维膜条。硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区(T)包被有特异性抗体，参照区(R)包被有抗小鼠IgG。测定时将试纸下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条移动。若标本中有待测的特异性抗原，则与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条(T)。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG)，而显出红色质控线条(R)。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。【材料】 HCG金标试纸条(早早孕试验试剂)、待测尿液。【方法】将白色一端插入尿液中，使用时尿液面不超过Max线，5秒钟后取出平放，3 min内观察结果。 斑点金免疫层析试验【结果判断】出现一条红线者为阴性；出现两条红线者为阳性；如无红线出现，表明试纸条失效。早早孕试验阳性说明孕妇尿中含有绒毛膜促性腺激素（HCG）；阴性则说明尿中无HCG。【思考题】1、何谓免疫标记技术？比较其各种试验的优缺点？2、ELISA有何优点，可用于哪些检测?3、免疫胶体金标记技术有何优点，可用于哪些检测?四、吞噬细胞的吞噬试验【目的】吞噬细胞是机体天然抵抗力的一个重要组成部分。吞噬细胞分小吞噬细胞和大吞噬细胞两类，前者为外周血中的中性粒细胞，后者包括外周血中的单核细胞和组织中的巨噬细胞。它们能吞噬和杀灭血液、组织中的病原微生物及衰老、损伤或癌变细胞。吞噬细胞数量减少或功能障碍均可