农杆菌介导的水稻转化.doc

农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1. 取-70保存的农杆菌EHA105于含50g/ml利福平YM平板划线，28黑暗培养。2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28振荡培养12-16小时。3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28，220rpm振荡培养至OD600=0.5。4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5分钟,去上清液。5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20分钟后，4，5000rpm离心5分钟，去上清。6. 加入4ml预冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200l冻存于-70。1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1g左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30分钟，-70放置3分钟 ，42水浴1-2分钟，加入800mlYM液体培养基28，175rpm摇培2-3小时后涂在含50g/ml Kanamycin的YM平板上，28培养。1.3农杆菌转化子的PCR鉴定将农杆菌转化子，用PCR方法鉴定是否正确转进EHA105中。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50g/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28，220rpm摇培16小时，直接用菌液做PCR。PCR所用的引物为pCAMBIA1301载体上特异性的引物FP35S：5-TAC GCA CAA TCC CAC TAT CCT T-3，RPGUS：5-CTG ATG CTC CAT CAC TTC CTG A-3。PCR反应参数设置： 94预变性3分钟 后开始以下循环反应：94变性30秒，50退火1分钟 ，72延伸1分钟，35个循环后72继续延伸10分钟，反应结束后，取20l反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。PCR反应体系母液浓度体积终浓度农杆菌转化子菌液体2lP1 2M2l200nMP2 2M2l200nM10PCR Buffer2lMg2+25mM1.2l1.5mMdNTP2.5mM1.2l150MTaq酶5U/l0.2l1UH2O9.4l终体积20l2. 根癌农杆菌介导的水稻转化2.1. 水稻转化受体的准备2.1.1. 水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟进行表面灭菌，灭菌时要经常搅拌。用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。2.1.2. 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。2.2. 农杆菌的培养将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线,28黑暗培养2-3天,用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5,加入AS，使AS终浓度为100m,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。2.3. 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养挑选状态较好（继代培养5-7天、色泽淡黄）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可),室温放置20分钟,并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26黑暗培养2-3天。2.4. 抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。2.5. 抗性愈伤组织的分化从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。2.6. 生根、壮苗和移栽当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。培养基诱导培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.5 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l pH 5.8继代培养基 同诱导培养基，但是2,4-D浓度改为 2.0mg/L共培养（固体）培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0mg/L + CH 500mg/l + 肌醇2000 mg/L + AS 100M + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6g/l pH 5.5(液体选择培养基无Gelrite)选择培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0 mg/L + proline 500 mg/l +glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 g/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8 分化培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + NAA 0.1 mg/L + KT 4 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 g/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8生根培养基 1/2 MS/N6大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + 蔗糖 30g/l + Agar 0.8% pHBasic培养基 N6（大量） 50ml （20倍） Ms-Fe盐 10-20ml（100倍） CH 0.3g/LB5 macro 10ml （100倍） phytogel 4g/L或 agar 8g/L B5 vita 10ml （100倍） sucrose 30g/L proline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子) 终浓度 母液(20倍) 终浓度 母液(20倍)KNO3 2830mg/L 56.6g/L MgSO4.7H2O 185 mg/L 3.7 g/L(NH4)2SO4 463 mg/L 9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/LKH2PO4 400 mg/L 8.00 g/L制备 1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解. 2 MgSO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀. 3 CaCl2.2H2O的配制同MgSO4.7H2O 4 配好后放于棕色瓶4保存MS(大量籼稻种子) 终浓度 母液(20倍) 终浓度 母液(20倍)KNO3 1900 mg/L 38g/L MgSO4.7H2O 370 mg/L 7.4 g/LNH4NO3 1650 mg/L 33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L 8.8 g/LKH2PO4 170 mg/L 3.4 g/L制备 1 KNO3, NH4NO3, MgSO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌 2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 3 CaCl2.2H2O同KH2PO4 4 配好后放于棕色瓶4保存MS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁) 终浓度 母液(100倍) FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L 制备 1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4保存B5 vitamin 终浓度 母液(100倍) 终浓度 母液(100倍) 肌醇 100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l 0.1g/l pyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L 1 g/l棕色瓶4保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/L Na2MnO4.2H2O 0.25mg/L CuSO4 0.025mg/L CoCl2 0.025mg/L2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配. 配好后4保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4保存 6