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中山大学 博士学位论文 人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋白和 B 晶状 体蛋白含量的影响 姓名 杨静 申请学位级别 博士 专业 眼科学 指导教师 刘奕志 20100520 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋白和QB 晶状体蛋白含量的影响 人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋 白和t t B 一晶状体蛋白含量的影响 专业 眼科学 博士生 杨静 导师 刘奕志教授 中文摘要 研究目的 研究人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因表达与波形蛋白和aB 一晶状体蛋白 的关系 材料和方法 眼组织来源 人尸体眼球来源于中山眼科中心眼库 所有与尸体解剖相关性 的研究均己通过中山大学人文伦理委员会的许可 我们所有的研究均遵照政府 及相关公共组织的关于人类及动物实验伦理道德条款 人晶状体原代上皮细胞的培养 晶状体上皮细胞贴敷于尸体眼的晶状体前囊 膜下 在解剖显微镜下 撕取晶状体的前囊膜 平铺于培养皿底部 上皮细胞 面向上 滴取一滴胎牛血清与上皮细胞面 保持细胞面的湿润 放于3 7 0 5 C 0 2 的培养箱孵育2 小时 使前囊膜充分贴敷于培养皿的底部 用含2 0 胎牛 血清的D M E M 培养液于培养箱中进行培养 采用G e n S c r i p t ss i R N Ad e s i g nc e n t e rs i R N AT a r g e tF i n d e r 和s i R N AC o n s t r u c t B u i l d e r 软件设计三个s h R N A 序列 用于人P E D F 基因的R N A 干扰 运用标准 的分子生物学技术将这些寡核苷酸序列克隆到质粒载体S D l 2 1l 上 然后通过 G a t e w a y 技术将设计的寡核苷酸序列克隆到p L e n t i 6 V 5 D T O P O 质粒载体中 用于慢病毒的产生 在用慢病毒感染细胞4 8 小时后 用R N e a s yp l u sM i n ik i t 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E O F 基因下调对波形蛋白和Q8 晶状体蛋白含量的影响 提取细胞中的总R N A 做三次重复的实时定量多聚酶链式反应 R e a l t i m eP C R 实验中我们采用家族管理基因G A P D H 作为对照基因 用A A C t 得出不同组P E D F 基因R N A 水平含量的差别 人原代晶状体上皮细胞P E D F 基因R N A 干扰4 8 小时后 W e s t e r nB l o t 方法检测其中波形蛋白以及a B 晶状体球蛋白表达水平的 变化 结果 人晶状体原代上皮细胞的培养 带有晶状体上皮细胞的人晶状体前囊膜完整的贴敷于培养皿上 2 4 小时观察 到健康的晶状体上皮细胞贴敷于前囊膜上 5 天后晶状体上皮细胞溢出囊膜范 围 迁移到培养皿上 1 0 天后 培养皿上上皮细胞达到7 0 8 0 的融合 并且 呈现出正常的上皮源性细胞的形态特征 慢病毒感染人原代晶状体上皮细胞 鉴于普通质粒转染技术在原代上皮细胞上 的成功率比较低 所以我们构建了慢病毒载体结构来表达s h R N A 以达到对P E D F 基因下调的目的 同时我们在构建的s h R N A 结构中表达绿色荧光 G F P 片断 以便于观察感染的效率 在荧光显微镜下 对感染4 8 小时后的细胞照相 我们 发现每一组的感染率都在8 0 9 6 左右 s h R N A 作用下P E D F 基因被下调的效果鉴定 表达相应s h R N A 的慢病毒感染人晶状体原代上皮细胞4 8 小时后 收集细胞 提取R N A 用定量聚合酶链式反应 R e a l t i m eP C R 检测P E D F 基因m R N A 水平 的表达变化 最终发现 未经任何慢病毒感染的对照组 以及表达非特异性随 机序列s h R N A s c r a m b l eg r o u p 的慢病毒组P E D F 的m R N A 在大致相同的表达 水平 其余的三种针对于P E D F 基因进行特异性R N A 干扰的慢病毒组 其P E D F 的R N A 水平与对照组以及s c r a m b l e 组比较均有显著的下调 p O 0 1 P E D F 基因被干扰后波形蛋白以及QB 一晶状体球蛋白含量的变化 用W e s t e r nB l o t 的方法检测对P E D F 基因进行R N A 干扰4 8 小时后波形蛋白以 及QB 一晶状体球蛋白含量的变化 用G A P D H 作为内参基因 与未经感染的对照 组比较 aB 一晶状体球蛋白的表达量在s h R N A s c r a m b l e 组中增加 3 0 9 6 在 s h R N A l 试验组明显增加 2 1 9 9 6 在s h R N A 2 试验组增加 2 0 4 在s h R N A 一3 试 验组增加 9 3 波形蛋白的表达量在s h R N A s c r a m b l e 试验组组中降低约 1 3 n 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E O F 基因下调对波形蛋白和aB 晶状体蛋白含量的影响 在s h R N A 1 试验组中明显降低约 7 2 s h R N A 2 试验组中降低 7 9 9 6 在 s h R N A 一3 试验组中降低 9 3 这项试验结果显示在特异性针对P E D F 基因进行R N A 干扰的试验组 s h R N A2 s h R N A 3 和s h R N A 4 波形蛋白的表达量明显降低 而QB 一晶状体球蛋白的表达量却显著升高 P 0 0 5 O n e w a yA N O V A a n a l y s i s 取用标准误S E Me r r o rb a r s n 3 结论 本研究表明 通过R N A 干扰技术下调P E D F 基因 可引起人晶状体上皮细 胞中a B 晶状体蛋白的表达增加以及波形蛋白的表达下降 波形蛋白和a B 一晶状 体蛋白是维持人晶状体透明性的重要蛋白质 并且在白内障的形成中都会有所 改变 因此 P E D F 基因的下调与白内障形成之间存在着某种联系 关键词 P E D F R N A 干扰 波形蛋白 a B 晶状体蛋白 人晶状体上皮细胞 I I 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中p E D F 基因下调对波形蛋白和oB 晶状体蛋白含量的影响 D o w n r e g u l a t i o no fP E D Fg e n ei nt h eh u m a n l e n s e p i t h e l i u mc e l l sc h a n g e dt h ee x p r e s s i o no fp r o t e i n V i m e n t i na n da B c r y s t a l l i n M a j o r O p h t h a l m o l o g y N a m e Y a n gJ i n g S u p e r v i s o r L i uY i z h i A b s t r a c t P u r p o s e o ft h es t u d y T os t u d yr e l a t i o n s h i po fP i g m e n te p i t h e l i u m d e r i v e df a c t o r P E D F e x p r e s s i o n w i t ht h ee x p r e s s i o no f v i m e n t i na n da B c r y s t a l l i nb yl e n se p i t h e l i a lc e l l s M a t e r i a l sa n dM e t h o d s S o u r c eo fe y et i s s u e sH u m a ne y e sw e r eo b t a i n e df r o mc a d a v e r st h r o u g ht h e Z h o n g S h a nO p h t h a l m i cc e n t e re y eB a n k I n v e s t i g a t i o n st h a ti n v o l v e do n l yr e s i d u a l m a t e r i a lf r o ma u t o p s y w a sa p p r o v e db yt h eH u m a nS u b j e c t sC o m m i t t e eo f S u n y e t S e nU n i v e r s i t y W ec e r t i f yt h a ta l la p p l i c a b l ei n s t i t u t i o n a la n dg o v e r n m e n t a l r e g u l a t i o n sc o n c e r n i n gt h ee t h i c a lu s eo fh u m a nv o l u n t e e r s a n i m a l sw e r ef o l l o w e d d u r i n gt h i sr e s e a r c h H u m a ne p i t h e l i a lc e l l s p r i m a r yc u l t u r e L e n se p i t h e l i a lc e l l sa d h e r i n gt o a n t e r i o rc a p s u l e sw e r eh a r v e s t e df r o mc a d a v e rl e n s e s U n d e ra d i s s e c t i n gm i c r o s c o p e l e n sc a p s u l e sw e r es p r e a de p i t h e l i u ms i d eu p As i n g l ed r o po ff e t a lb o v i n es e r u m w a sp l a c e do nt h ee p i t h e l i a ls u r f a c et op r e v e n td e s i c c a t i o n I n c u b a t i o nf o r2h o u r sa t 3 7d e g r e e sCa n d5 C 0 2w a sp e r f o r m e dt oa l l o wf o ra d e q u a t ea d h e r e n c eo ft h e t i s s u et ot h ed i s h D M E Dm a d et o2 0 F B SW a st h e na d d e da n dt h ec e l l s i n c u b a t e df o ra tt h es a m ec o n d i t i o n su n t i lf u a h e re x p e r i m e n t a t i o n P r i m a r yh u m a nl e n se p i t h e l i a lc e l l sI n f e c t i o n W ed e s i g n e dt h r e es h R N A s e q u e n c e sd i r e c t e da g a i n s th u m a nP E D Fu s i n gt h eG e n S c r i p t Ss i R N Ad e s i g nc e n t e r l V 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋白和a8 昌状体蛋白含量的影响 s i R N AT a r g e tF i n d e ra n ds i R N AC o n s t r u c tB u i l d e r O l i g o n u e l e o t i d e sc o r r e s p o n d i n g t ot h e s es e q u e n c e sw e r ec l o n e du s i n gs t a n d a r dm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e si n t o P l a s m i d v e c t o r S D I211 f o rt r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n e x p e r i m e n t s a n di n t o p L e n t i 6 N 5 一D T O P Of o rg e n e r a t i o no f l e n t i v i r a ls h R N A p a r t i c l e s R T P C RT o t a lR N Aw a se x t r a c t e dw i t hR N e a s yp l u sM i n ik i tf r o mt h ep r i m a r y h u m a nl e n se p i t h e l i a lc e l l s2d a y sa f t e ri n f e c t i o nw i t hs h R N A e x p r e s s i o nv e c t o r s R N A s a m p l e sw e r em a d et ot h es a m ec o n c e n t r a t i o np r i o rt oc D N As y n t h e s i su s i 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n d a r dp l a s m i db a s e dt r a n s f e c t i o nt e c h n i q u e s w eu t i l i z e dl e n t i v i r a lv e c t o r st o e x p r e s ss h R N Ac o n s t r u c t sf o rt h ed o w n r e g u l a t i o no fP E D EC o e x p r e s s i o no fG F P w i t ht h es h R N Ac o n s t r u c t sa l l o w e df o rt h ee v a l u a t i o no ft h ee f f i c i e n c yo fg e n e t r a n s f e rt op r i m a r yl e n se p i t h e l i u mi nc u l t u r e E p i t h e l i a lc e l l sw e r ei m a g e dv i a f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y4 8h o u ra f t e rt r a n s d u c t i o nw i t hs h R N Ac o n s t r u c t sa n d 代 f o u n dt h a ti ne a c hc a s ea p p r o x i m a t e l y8 0 o fc e l l sw e r et r a n s d u c e d D o w n r e g u l a t i o no fP E D Fe x p r e s s i o nb ys h R N Av e c t o r sW en e x ta n a l y z e dt h e a b i l i t yf o rs h R N A d i r e c t e da g a i n s tP E D Ft od o w n r e g u l a t eP E D Fg e n ee x p r e s s i o n 4 8 h o u r sa f t e rt r a n s d u c t i o n 诵ms h R N A e x p r e s s i n gl e n t i v i r a lc o n s t r u c t s p r i m a r yl e n s V 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E O I r 基因下调对波形蛋白和aB 晶状体蛋白含量的影响 e p i t h e l i a lc e l l sw e r eh a r v e s t e da n dP E D Fm R N Ae x p r e s s i o nd e t e r m i n e db yq P C R N o n t r a n s f e c t e dc e l l sa n dc e l l st r a n s f e e t e dw i t hn o n s p e c i f i cs c r a m b l e ds h R N Av e c t o r h a di d e n t i c a lP E D Fg e n ee x p r e s s i o n A l lt h r e eP E D Fs h R N A ss i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d p 0 01 t h ee x p r e s s i o no fP E D Fi nt h ep r i m a r ye p i t h e l i a l c u l t u r e sa s c o m p a r e dt oc o n t r o la n ds h R N A S C Rg r o u p s V i m e n t i na n da B c r y s t a i l i ne x p r e s s i o na lem o d u l a t e db ys h R N Ad i r e c t e d a g a i n s tP E D F G i v e nt h ek n o w nc h a n g e si nP E D F e x p r e s s i o ni nc a t a r c t o u sl e n s e s w en e x tl o o k e da tt h ec h a n g e si nk e yl e n ss t r u c t u r a lp r o t e i n si m p l i c a t e di nt h e f o r m a t i o no fc a t a r a c tf o l l o w i n gt h ed o w n r e g u l m i o no fP E D Fe x p r e s s i o nb ys h R N A W e s t e r nb l o t t i n gw a su s e dt od e t e r m i n et h ec o n c o m i t a n te f f e c t so fP E D Fd i r e c t e d s h R N Ao nt h ee x p r e s s i o no fv i m e n t i na n da B c r y s t a l l i n F i g u r e 7i st h e d i s t r i b u t i o no fv i m e n t i na n da B c r y s t a l l i n a n dt h ea n a l y s i so fp r o t e i ne x p r e s s i o n l e v e li nd i f f e r e n tg r o u p4 8h o u r sa f t e ri n f e c t i o n C o m p a r e dw i t hn o n t r a n s f e c t e d g r o u p a B c r y s t a l l i ne x p r e s s i o nh i g h e ra b o u t 3 0 i ns h R N A s c r a m b l eg r o u p 219 i ns h R N A Ig r o u p 2 0 4 i ns h R N A 2g r o u p 9 3 i ns h R N A 3g r o u p V i m e n t i ne x p r e s s i o nl o w e ra b o u t l3 i ns h R N A s c r a m b l eg r o u p 7 2 i n s h R N A Ig r 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h i pb e t w e e nt h ed o w nr e g u l a t i o no fP E D Fa n d c a t a r a c t K e y W o r d s P E D F R N A i V i m e n t i n a B c r y s t a l l i n H u m a nl e n se p i t h e l i a lc e l l s V I 培养皿http www huayu 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 独立 进行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论 文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果 对本 文的研究做出重要贡献的个人的集体 均已在文中以明确的方式标 明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 杨静 日期 2 0 1 0 年5 月2 0 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学 校有权保留论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子板 和纸质版 有权将学位论文用于非盈利目的的少量复制并允许论文 进入学校图书馆 院系资料室被查阅 有权将学位论文的内容便如 有关数据库进行检索 可以采用复印 编印或其他方法保存学位论 文 学位论文作者签名 杨静 日期 2 0 1 0 年5 月2 0 日 导师签名 刘奕志 日期 2 0 1 0 年5 月2 0 日 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E O F 基因下调对波形蛋白和a8 晶状体蛋白含量的影响 2I 亡 了I 甭 色素上皮衍生因子 P E D F 是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员 它可以 表达于所有的眼组织 1 并且积聚于房水中 2 它是一种遗传因子 可以防止神 经细胞自然或外因诱导性的凋亡 3 晶状体的功能随年龄而退化 氧化 紫外 线 以及其它的有害因子都可导致体内或体外的自内障形成 4 5 6 老年性白内 障的形成是一个普遍的老龄化进程 它伴随有许多的晶状体细胞的形态和功能 的变化 不论是在人体还是其他动物体内 晶状体上皮细胞的凋亡似乎是所有 的非先天性白内障 包括老年性白内障 形成的细胞学基础 我们之前的研究发现P E D F 基因可以表达于房水以及晶状体上皮细胞中 并 且表达水平随着年龄的增长会有显著性的降低 这就提示我们 可能P E D F 基 因能通过自分泌或者旁分泌的通路对晶状体上皮细胞起到调节或者保护的作 用 另外 一项通过c D N A 微矩阵技术 m i c r o a r r a r yt e c h n i q u e 对老年性自内障病 人的晶状体上皮细胞所做的分子学特性研究中 发现在老年性白内障中 色素 上皮衍生因子 P E D F 被明显下调大约5 9 倍 9 据目前所知 P E D F 基因对 于正常透明晶状体的生理和发育都起着非常重要的作用 1 0 然而众所周知 晶 状体的混浊又常常是由于蛋白质错配跟聚合而造成的 因此我们猜测可能在 P E D F 基因和某些晶状体蛋白质之间会存在着某种联系 然而目前并没有相关 方面的研究 因此我们设计了这个实验去观察P E D F 基因的下调是否可以改变 晶状体波形蛋白以及a B 晶状体球蛋白的表达 我们之所以会选择波形蛋白以及a B 晶状体球蛋白作为研究对象 是因为它 们对晶状体是非常重要的蛋白质 a B 晶状体球蛋白是小热休克蛋白家族中的一 员 是脊椎动物晶状体主导蛋白之一 并且可以作为构成性的蛋白质低水平的 表达于晶状体上皮以及其他多种组织中 1 1 1 4 目前已经证明许多因子在白内障 形成过程中晶状体球蛋白的聚合和交叉耦合中发挥作用 b a B 晶状体球蛋白除了是晶状体的主要蛋白质以外 还广泛存在于脊椎动物的 非晶状体组织中发挥着公认的非折射性细胞学作用 1 2 1 6 1 9 那些携带有a B 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋白和aB 晶状体蛋白含量的影响 晶状体球蛋白错义突变的病人 往往会发展成肌闽线蛋白相关性肌病和白内障 2 0 另外 由于晶状体的上皮细胞在整个生命过程中都必须保持在细胞分裂周期 的G 0 期 因此维持基因的完整性对于晶状体来说是至关重要的 2 1 2 2 曾经有 一项研究表明 在维持基因的稳定性方面a B 晶状体球蛋白可能是一个重要的 构成元件 2 3 a B 晶状体球蛋白耐热性的降低以及突变所到来的副作用 都可能 是白内障形成的直接因素 因为a B 晶状体球蛋白敲除的老鼠往往具有清晰的 晶状体 2 4 波形蛋白在人晶状体上皮细胞中是一个重要的细胞骨架 它呈现出一种独特 的几乎与所有已知的中间丝蛋白相关的表达 2 5 它主要表达于问叶细胞源性的 细胞中 但同时特也表达于一些未分化细胞以及人工养殖的细胞中 波形蛋白 主要表达于晶状体的上皮细胞中 之前有研究表明 波形蛋白的高表达可以强 有力的干扰晶状体细胞纤维的正常分化 正常的纤维细胞的分化过程被损害 随着晶状体的变性 动物即表现为显著的白内障 在各种转基因性的改变中 所有方面的不正常程度都与波形蛋白的表达水平有着直接的联系 2 6 波形蛋自 的过表达强有力的影响着晶状体正常的形态发生 2 6 波形蛋白的减少可以引起 细胞骨架的退化 从而英气晶状体上皮细胞的破坏 并且似乎与年龄相关性白 内障的形成有关 2 7 在这个实验中 我们发现通过R N A 干扰技术 R N A i 下调人原代晶状体上 皮细胞中P E D F 基因的表达 可以引起a B 晶状体球蛋白表达量的增加和波形 蛋白表达量的降低 2 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋白和aB 晶状体蛋白含量的影响 1 1 实验试剂和仪器 材料和方法 人晶状体原代上皮细胞的培养 3 7 C 0 5 C 0 2 培养箱 D u l b e c e o SM o d i f i e dE a g l e SM e d i u m D M E M 2 0 F B S 解剖显徼镜 3 5 C M 培养皿 1x P B S 溶液 慢病毒的制各 G e n S c r i p t Ss m a l li n t e r f e r i n gR N A s i R N A d e s i g nc e n t e r 的s i R N AT a 唱e tF i n d e r 软 件 和s i R N AC o n s t r u c tB u i l d e r 软件 质粒载体 S D l 2 11 p L e n t i 6 V 5 一D T O P O 载体 V i r a P o w e r r ML e n t i v i r a lE x p r e s s i o nS y s t e m s 1 n v i t r o g e n 广州 中国 2 9 3 F T 细胞 O p t i M E M Im e d i u m G I B C O l n v i t r o g e n 广州 中国 L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 1 n v i t r o g e n 广州 中国 细胞感染 5l x l m lD e x t r a i n S i g m a A l d r i c h l n v i t r o g e n 广州 中国 R N A 提取 R N e 舾yp l u sM i n ik i t Q i a g e n V a l e n c i a C A N a n o D r o p T M2 0 0 0s p e c t r o p h o t o m e t e r f r o mT h e r m oS c i e n t i f i c S t L o u i s M O 3 培养皿http www huayu 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E O F 基因下调对波形蛋白和QB 晶状体蛋白含量的影响 R T P C R H i g hC a p a c i t ye D N AR e v e r s eT r a n s c r i p t i o nK i t A p p l i e dB i o s y s t e m s l n v i t r o g e n 广 州 中国 S t e p O n e T MR e a l T i m eP C RS y s t e mf r o mA p p l i e dB i o s y s t e m s P o w e rS Y B RG r e e nP C RM a s t e rM i x A p p l i e dB i o s y s t e m s I n v i t r o g e n 广州 中国 W e s t e r n B l o tA s s a y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e P B S p H7 4 1 G I B C O I n v i t r o g e n T r i s 溶液 1 n v i t r o g e n 5 0m M p H7 5 5 m M e t h y l e n e d i n i t r i l o t e t r a a c e t i ca c i d E D T A l n v i t r o g e n 3 0 0m M 氯化钠溶液 0 1 I g e p a l 0 5m M 氟化钠 0 5m M N a 3 V 0 4 a n t i p r o t e a s em i x t u r e R o c h eM o l e c u l a rB i o c h e m i c a l s I n v i t r o g e n 广州 中国 0 5m M p h e n y l m e t h a n es u l f o n y lf l u o r i d e P M S F 抗体说明 v i m e n t i n 一抗 公司 s a n t ac r u z 名称 v i m e n t i n 种属来源 G o a to rR a b b i t 货号 S C 7 5 5 8 a B c r y s t a l l i n 一抗 公司 s a n t a c n l z 名称 a B c r y s t a l l i n 种属来源 R a b b i t 货号 s e 2 2 7 4 4 G A P D H 一抗 公司 p r o t e i n t e c hg r o u p 名称 G A P D H 种属来源 R a b b i t 4 中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋白和aB 晶状体蛋白含量的影响 货号 1 0 4 9 4 1 A P 1 2 实验方法 眼组织来源 人尸体眼球来源于中山眼科中心眼库 所有与尸体解剖相关性 的研究均已通过中山大学人文伦理委员会的许可 我们所有的研究均遵照政府 及相关公共组织的关于人类及动物实验伦理道德条款 一 人晶状体原代上皮细胞的培养 晶状体上皮细胞贴敷于尸体眼的晶状体前囊 膜上 在解剖显微镜下 撕取晶状体的前囊膜 平铺于培养皿底部 上皮细胞 面向上 滴取一滴胎牛血清与行脾细胞面 保持细胞面的湿润 放于3 7 度0 5 C 0 2 的培养箱孵育2 小时 使前囊膜充分贴敷于培养皿的底部 用含2 0 9 6 胎牛 血清的D M E M 培养液于培养箱中进行培养 二 人晶状体原代上皮细胞的感染 设计s i R N A 序列如下 s i R N As c r a m b l ei n s e r t 7 6b p s a m p l e1 C C 沁T G A T A A T T C T A A T G G C G T T T G A T A T C C G A C G C C A T T A G A A T T A T C A C C G A n t i s e n s e fL o o plS e n s e s i R N Ai n s e r t1 7 6b p s a m p l e2 T C T T G C A G T T G A G A T C A G A G T T T G A T A T C c G A C T c T G A T C T C 从C T G C A A G A A n t i s e n s e IL o o plS e n s e s i R N Ai n s e r t2 7 6b p s a m p l e3 T C T C A G G G T A C A G A T C G T A T T G A T A T C C G T A C G A T C T G T A C C G C C T G A G A A n t i s e n s e jL o o plS e n s e s i P N Ai n s e r t3 7 6b p s a m p l e 4 T 从G c C A C G C C 从G G A G 从G G T T G A T A T c c G C C T T c T C C T T G G C G TG G l C l r A A n t i s e n s eIL o o plS e n s e 5 中山大学博士论文人原代昌状体上皮细胞中P E D F 基因下调对波形蛋白和Q8 昌状体蛋白含量的影响 我们运用软件G e n S c r i p t ss i R N Ad e s i g nc e n t e rs i R N AT a r g e tF i n d e r 和 s i R N AC o n s t r u c tB u i l d e r 设计了三个s h R N A 序列 用于人的P E D F 基因的R N A 干扰 运用标准的分子生物学技术将这些寡核苷酸序列克隆到质粒载体S D l 2 1 1 上 然后通过G a t e w a y 技术将设计的寡核苷酸序列克隆到p L e n t i 6 V 5 一D T O P O 质粒载体中

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