国光’ 芽变 花青苷 MYB DNA甲基化论文.doc

国光论文：国光苹果红色芽变果实着色分子机理初步研究【中文摘要】苹果(Malus domestica Borkh)是世界上最主要的鲜食果品之一,其果实色泽是重要的外观品质,直接决定其商品价值。国光是20世纪80年代中国北方广泛种植的苹果品种之一,具有晚熟、酸甜适口及抗逆性强等特点,近年来再次受到消费者的青睐,但着色差一直是限制其发展的重要因素。2005年课题组在山东省五莲县发现了一株国光的红色突变,其突出的特点是比国光着色早,着色好,成熟时果面片红。果皮的红色主要由花青苷类物质的含量和成分决定的,花青苷是由一系列的酶促反应生成的次生代谢物。前人以国光为对照,从生理层面上对红色芽变花青苷积累及合成途径关键酶的活性进行了研究。本文在此基础上,比较了两试材中花青苷合成相关结构基因、调节基因的表达水平以及三个调节基因的编码区,找出了引发红色突变的关键基因;并通过对关键基因MdMYB1基因组和上、下游调控序列的扩增和比对,以及MdMYB1启动子区域的甲基化状态的比较,阐明了MdMYB1表达量差异的原因。主要研究结果如下:1.果实发育后期正常光照条件下的果实MdCHS、MdF3H、和MdUFGT表达量逐渐上升,采收前达到最大值;MdCHI、MdDFR1及MdLDO.【英文摘要】Apple (Malusdomestica Borkh) is one of several main types of fresh fruits in the world. Skin color is an important component of fruit quality and significantly influences the market value of apple fruits.Rallsapple is one of the apple cultivars that widely planted in northern China in 1980s. It has the characters of late maturing, good flavors and strong stress resistance and has regained popularity with people in recent years. But poor coloration is the main limiting factor of its development. In 2005, .【关键词】国光 芽变 花青苷 MYB DNA甲基化【英文关键词】Rallsapple bud sport anthocyanin MYB DNA methylation【目录】国光苹果红色芽变果实着色分子机理初步研究中文摘要9-11ABSTRACT11-121 引言13-281.1 果树芽变的分子机理研究进展13-161.1.1 反转录转座子的插入141.1.2 DNA 甲基化状态的改变14-151.1.3 基因结构的突变15-161.2 花青苷的生物合成及其调控16-251.2.1 植物花青苷的结构和种类16-171.2.2 花青苷的性质及功能171.2.3 花青苷的生物合成17-191.2.4 光照对花青苷合成的影响19-201.2.5 花青苷合成的调控20-251.2.5.1 花青苷合成的酶及结构基因20-241.2.5.2 调控花青苷合成的转录因子24-251.3 本研究的目的意义25-282 材料与方法28-372.1 实验材料28-292.1.1 植物材料282.1.2 菌株及载体282.1.3 主要药品试剂、试剂盒及仪器设备28-292.1.4 PCR 引物合成与测序292.2 实验方法29-372.2.1 植物基因组DNA 提取292.2.1.1 CTAB 法提取植物基因组DNA292.2.1.2 植物基因组质量检测292.2.2 植物总RNA 提取29-312.2.2.1 CTAB 法提取植物总RNA302.2.2.2 RNA 含量和纯度检测30-312.2.3 cDNA 第一链的合成312.2.4 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)31-322.2.5 调节基因编码区及MdMYB1 基因组序列扩增322.2.6 PCR 产物的回收32-332.2.7 PCR 产物的克隆测序33-342.2.7.1 重组载体的构建332.2.7.2 大肠杆菌DH5感受态细胞的制备33-342.2.7.3 重组载体转化感受态细胞342.2.7.4 阳性克隆的筛选及测序342.2.8 MdMYB1 基因组上、下游调控序列的扩增342.2.9 基因组DNA 的亚硫酸氢盐测序分析34-362.2.9.1 基因组DNA 的甲基化修饰34-352.2.9.2 纯化亚硫酸盐修饰的DNA35-362.2.9.3 甲基化PCR 扩增及序列测定362.2.10 基因序列分析及数据统计方法36-373 结果与分析37-493.1 DNA 和RNA 提取及质量检测373.2 果实发育后期果皮类黄酮合成结构基因表达分析37-403.2.1 花青苷合成结构基因表达分析37-393.2.2 黄酮醇、单宁合成结构基因表达分析39-403.3 花青苷合成相关调节基因cDNA 序列的扩增与表达分析40-453.3.1 调节基因cDNA 序列的扩增及序列分析40-433.3.2 调节基因表达分析43-453.4 MdMYB1 基因组及上、下游调控序列扩增比对分析45-473.4.1 MdMYB1 基因组序列的扩增及比对分析45-463.4.2 MdMYB1 上、下游非编码序列的扩增及比对分析46-473.5 MdMYB1 启动子区域甲基化状态检测47-494 讨论49-524.1 国光与其红色芽变花青苷合成结构基因表达