流动注射化学发光.docx

流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究 仪器分析实验2013-06流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究摘要 本实验采用利用盐酸环丙沙星对Ce（IV）-Na2SO3化学发光的增敏作用实现流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量研究，优化浓度后的流路设计为将浓度为 5.010-3mol/L 的 Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液充分混合后，加入 5.010-4mol/L 的 Ce4+ 进行发光检测。实验测得线性回归方程 y = 1704.83x + 377.32 （R2 = 0.9902），测得盐酸环丙沙星浓度为 1.32mg/L。经检验，本检测方法的检出限为 0.08001mg/L，相对标准偏差为2.75%。关键词 流动注射法 化学发光 盐酸环丙沙星 标准校准曲线法 条件优化1 引言盐酸环丙沙星属于第三代喹诺酮类药物，抗菌能力强，临床广泛应用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的感染，对 -内酰胺抗生素、氨基糖苷类以及四环素等多重药菌具有较好的抗菌活性1。目前，盐酸环丙沙星的测定方法有很多，主要有HPLC2、电位法3、比色法4、毛细管电泳法5、分光光度法6等。然而，这些方法往往存在仪器昂贵，操作复杂，测量耗时较长等问题。在碱性介质中，环丙沙星对鲁米诺-KIO4-Co2+ 反应体系产生的化学发光明显地受到抑制，且化学发光强度的抑制强度与环丙沙星的浓度成正比关系。在酸性条件下，盐酸环丙沙星对 Ce（IV）-Na2SO3 微弱化学发光体系具有很强的增敏作用，据此，建立了流动注射化学发光法测定盐酸环丙沙星的新方法7。相对于其他检测方法，化学发光由于不需要外来光源而消除了背景光的干扰，大大提高了检测精度。相对于传统注射技术，流动注射技术不仅具有低消耗高效率的优点，而且适应性广泛且测量精度高。流动注射-化学发光联用技术由于其操作简单快速、高精度和高效率等优点而在化学分析领域具有广泛的应用8。本实验采用流动注射-化学发光联用技术测定指定盐酸环丙沙星药片中盐酸环丙沙星含量，对实验条件优化后，通过检测其检出限和相对标准偏差评估该实验的准确性。实验证明本方法高灵敏度和较宽的动态范围，仪器简单，操作简捷，结果准确可靠。2 实验部分2.1 仪器与试剂2.1.1 仪器BPCL 微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）；HL-2D 恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；八通阀（杭州）；联机计算机。2.1.2 试剂硫酸铈溶液：4.010-4 mol/L（用0.05 mol/l 硫酸溶解）；亚硫酸钠溶液：8.010-2 mol/l；盐酸环丙沙星标准溶液：100.0 mg/L(用 0.04 mol/l 盐酸溶解)；盐酸环丙沙星滴眼液。所用试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。2.2 仪器预热1) 接通计算机电源，启动 windows 系统；打开 BPCL 主机电源，仪器预热 30min 以上，选择所需温度及负高压。打开快门开启BPCL测量程序，设定参数后启动测量。2) 清洗流路：开启蠕动泵，旋紧蠕动泵上面及两侧的4个旋钮，选择蠕动泵转向，打开蠕动泵，选择流速（可以用 60rpm ）。按图1组装流路，用 0.1mol/L 硝酸清洗流路，而后用 0.1mol/L NaOH 清洗流路，最后用二次蒸馏水清洗，直到基线稳定（当副高压为 -750V 时，基线在 100 单位化学发光信号为合适）。2.3 数据测量1) 用100.0mg/L (用0.04 mol/L盐酸溶解)的盐酸环丙沙星储备液，配置浓度为 0.1-10mg/L的盐酸环丙沙星标准溶液系列。2) 标准曲线的绘制：按图一流路测量，启动泵（流速为60rpm ），将Na2SO3溶液与盐酸环丙沙星溶液混合后，通过流动泵注入作为载流的酸性硫酸铈溶液中，微弱发光仪检测及纪录发光强度信号。重新启动测量程序，开始检测。首先测量空白溶液，按相同时间间隔（15s）旋转八通阀，得到信号峰，平行测量三次，标准系列由稀到浓进行测量，操作同空白，得到一条时间-峰值图，完成检测后选择停止检测，保存，导出为 .txt 或 .Xls 文件后，导入origin处理。绘制浓度-峰值标准曲线，线性拟合得浓度-峰值关系式。3) 盐酸环丙沙星滴眼液（规格5ml：15mg（按环丙沙星计）湖北东盛制药有限公司），按标示稀释为10mg/L的浓度，按（2）操作先走空白，空白的峰值和标准曲线相近，测量理论浓度为10mg/L（按环丙沙星计）的药片，均平行测量三次，完成检测后选择停止检测，保存，导出为 .txt 或 .xls 文件后，导入origin处理。读出峰值，按浓度-峰值关系式求出药片中的实际盐酸环丙沙星含量。2.4 清洗流路1) 清洗流路（同上面方法，最后将管中二次蒸馏水全部走光，保证管不被腐蚀），关闭快门旋松蠕动泵旋钮，关闭BPCL主机。2) 关闭电脑，洗净试剂瓶，容量瓶，清洁台面，关闭实验室电源方可离开。3 结果与讨论3.1 动力学曲线本实验设计了四种流路（表1）并分别得到四条动力学曲线（图 1）。表1 流路设计序号流路设计实验结果（1）先使 Ce4+ 溶液与 Na2SO3 溶液充分混合后，再迅速加入50L 盐酸环丙沙星溶液没有明显的发光信号（2）先使 Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液充分混合，再加入50L Ce4+ 溶液一个约 2500 强度的发光信号（3）在 Ce4+ 溶液中加入 50L Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液的混合溶液一个约 300 强度的发光信号（4）先按一定倍数稀释 Ce4+ 溶液，再加入 50L Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液的混合溶液一个约 2500 强度的发光信号和若干较弱发光信号动力学曲线（1） 动力学曲线（2）动力学曲线（3） 动力学曲线（4）图1 动力学曲线3.2 流路设计与装置连接由以上动力学曲线可知，化学发光来源于 Ce4+ 溶液与 Na2SO3 溶液反应，且 Ce4+ 本身的颜色会产生自吸现象。综上所述，本实验采用流路（2），其动力学曲线如下（图2）。图2 流路2得到的动力学曲线流路设计和装置示意图如下（图3）。P. 蠕动泵；V. 十六通阀；F. 流动池；M. 混合三通；W. 废 液； PMT. 光电倍增管；HV. 负 高 压； PC. 联机 电 脑；a：Na2SO3溶液； b：盐酸环丙沙星溶液； c：硫酸铈铵溶液图3 流动注射-化学发光系统示意图3.3 体系条件优化3.3.1 硫酸铈浓度的影响固定 Na2SO3 浓度为 810-4 mol/L，流速 60 rpm，分别在空白和 10 mg/L 标样的条件下考察 Ce4+ 溶液浓度在 110-5 510-3 mol/L 范围内变化对体系信号的影响。图4 硫酸铈浓度优化的时间-发光强度关系将上图数据整理记录于表2，绘制相对发光强度 I - Ce4+ 浓度关系图（图5）。 表2 相对发光强度与 Ce4+ 浓度关系c（Ce4+）/molL-11.010-55.010-51.010-45.010-41.010-32.510-35.010-3发光强度I空白343667710368307283263发光强度I环丙沙星3631855101211482336351143305发光强度I相对201188941114455332886042图5 相对发光强度 I - Ce4+ 浓度关系图 由图5可判断，最优 c（Ce4+）为 5.010-4 mol/L，此时体系发光强度最大。3.3.2 Na2SO3浓度的影响固定 Ce4+ 浓度为 5.010-4 mol/L（含硫酸浓度 0.05 mol/L），流速 60 rpm，分别在空白和 10 mg/L 的条件下考察 Na2SO3 在 1.010-4 1.010-1 mol/L 范围内变化时对信号值的影响。图6 亚硫酸钠浓度对发发光强度的影响数据记录于表3，并绘制出相对发光强度 I-Na2SO3 浓度 c 关系图。表3 亚硫酸钠浓度对发发光强度的影响c（Ce4+）/molL-11.010-45.010-41.010-35.010-31.010-25.010-21.010-1发光强度I空白3394374411244124510541061发光强度I环丙沙星3739138041358519597985027681493发光强度I相对340013367131441835386051714432图7 相对发光强度 I-Na2SO3 浓度 c 关系图由图7可判断，最优 c（Na2SO3）为 5.010-3 mol/L，此时体系发光强度最大.3.3.3 校准曲线、精密度和检出限在选定的最佳条件下，测量相对发光强度与盐酸环丙沙星浓度在 0.10 mg/L 15 mg/L 范围的关系，作出线性关系图，拟出回归方程。图8 线性相关浓度范围表4 标准溶液测定结果c样品/mgL00.100.300.500.801.03.05.08.0101215实测发光强度 I13381437188523322958340867221103416770202352176025664相对发光强度I099547994162020705384969615432188972042224326根据上表数据绘制盐酸环丙沙星标准校正曲线如图9，线性方程为：y = 1704.83x + 377.32 R2 = 0.9902 （1）图9 标准校准曲线对 5.000mg/L 盐酸环丙沙星平行测定11次，数据记录于表5。表5 空白样和标准溶液的相对发光强度次数1234567891011空白样品I空白11771178113411741133119812431211121912791238标准溶液I11924117141160012603124691251812336118911209912316根据 IUPAC 建议计算方法，计算出该方法的检出限为：DL = 3/S = 0.08081mg/L舍去一个实验操作导致的异常值，相对标准偏差 R.S.D = 2.65%.3.4 样品测定取盐酸环丙沙星片剂用二次蒸馏水稀释为不同的浓度，平行测定空白与样品溶液的发光强度，数据记录与表6。表6 样品含量测定数据测定次数123空白 I132312571251样品 I345043313919相对发光强度 I212730742668样品浓度（mg/L）1.031.581.34样品平均含量（mg/L）1.32将所测数据代入方程（1），计算得盐酸环丙沙星的浓度 c = 1.32mg/L。3.5 讨论本实验在配制标准溶液时，由于浓度较小进样量较大，为了保证精确度又使标准溶液足够使用，因此采用隔开一个浓度的逐级稀释方法配制标准溶液。在测动力学曲线时，流路设计（4）中出现多个较弱发光信号的原因可能是加入 50L Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液的混合溶液时速度较慢，造成溶液分多次加入。本实验的线性回归方程相关系数不太理想，可能是由于化学发光体系本身精密度的限制和配制标准溶液时差生较大误差导致。中途更换十六通阀的操作者，可能对整个实验的精确度产生一定影响。4. 结论本实验采用流动注射-化学发光联用分析法，优化浓度后的流路设计为将浓度为 5.010-3mol/L 的 Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液充分混合后，加入 5.010-4mol/L 的 Ce4+ 进行发光检测。实验测得线性回归方程 y = 1704.83x + 377.32 （R2 = 0.9902），测得盐酸环丙沙星浓度为 1.32mg/L。经检验，本检测方法的检出限为 0.08001mg/L，相对标准偏差为2.75%，表明该方法操作简便迅速，测定结果准确可靠。参考文献1 唐玉海, 姚宏, 孙媛媛. 流动注射抑制化学发光法测定盐酸环丙沙星J. 理化检验（化学分册）, 2007， 08:639-641.2 李章万, 敦平, 敦群. 药物分析杂志, 1994, 14（2）：16-18.3 修荣, 黄超伦, 王伟, 潘振华. 酸碱双点电位法测定盐酸环丙沙星的含量J. 分析化学学报, 2005, 03:351-352.4 唐湘红, 徐浩嘉, 屠婕红. 比色法测定盐酸环丙沙星片含量. 现代应用化学, 1993年06期：38-39.5 曾海虹, 邱涵, 陈素俭. 高效毛细管电泳测定盐酸环丙沙星的含量. 海峡要学, 2001年第13卷第3期：51-52.6 Sutan S M, 周执中. 流动注射分光光度法测定制剂中的环丙沙星J. 国外医药抗生素分册, 1994, 15（3）：1752178.7 梁耀东, 李建中, 章竹君. 流动注射-化学发光法测定盐酸环丙沙星. 分析化学, 1997年11月第25卷第11期：1307-1310.8 田进军, 薛艳. 流动注射-化学发光分析法应用研究进展J. 分析测试技术与仪器, 2006, 12（2）：75-81.附录：思考题1. 化学发光和其它分子发光（荧光、磷光）的有什么异同点？答：化学发光和其它分子发光同属于分子发光，其原理都是由于分子的外层电子在辐射能的照射下吸收能量跃迁到激发态后返回基