转染 资料大全.doc

最好同时设计几对，选择效果较好的，别忘了做对照（GFP）,排除非特异性干1.不同的细胞及转染试剂对于质粒和脂质体的比例要求是不同的，所以在正式实验前必须摸索一个最佳转染比例。总的来说，细胞系较原代好转，脂质体的用量以说明书为参考上下浮动。2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题。所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些。（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）一般在转染后46小时补加血清，可以就在你原来的无血清培养基中滴两滴血清。如果你觉得LF2000可能对你的细胞有毒性作用的话（一般LF2000的毒性不至于很大，可以不用更换培养基，具体看你细胞的生成状态了），你可以把原来的无血清培养基吸出来，更换成含血清的培养基。在转染后的46小时，最好不要动你的细胞，让它安静地躺着，因为此时细胞最为脆弱，不合适的动荡会使其死亡率增加。lipofectamine2000转染后在6小时左右最好换液且换为有血清的血清，其一因为lipofectamine2000对细胞的毒性作用还是有的，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。可时时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。转染全程都不应加有抗生素的，我刚刚做完LP2000转染的，把我的一点经验告诉你啊：1.加完脂质体DNA混合物后细胞就出现小黑点，这很正常的，因为LP2000即使毒性再小它也是有毒性的，减轻的办法就是45小时把混合物去掉换有血清的新培养基培养，我做之前看有些战友的意见毒性大3小时换也行的。2.我的是在无血清的DMEM下转的，推荐买OPTI-MEM，但到货一个月，我也没用，不过还可以的3.多摸几个浓度比例，找出最适合的，如果有报告基因就最好了，但是我的也没有。4.细胞密度要够哇，80左右吧，我感觉细胞死的还挺多的。5.按照LP2000操作说明来做，基本上没问题的。6.这个我应该建议你在做之前搜索本版，好好看看战友的经验，绝对受益匪浅啊RT-PCR检测转染提取RNA中混杂有少量质粒DNA会出现RT-PCR假阳性。 排除方法：设一阴性对照，用提取的RNA（不经RT）直接作模板进行PCR扩增。我准备研究某基因功能，构建了重组表达质粒（以荧光素酶为报告).现准备转染细胞，并以不含目的基因的质粒作对照。请问： 1.如果以beta-gal质粒共转染作内参，荧光素酶活性如何校正？ 2.如果以beta-gal质粒共转染作内参，各种条件转染需作复孔吗？ 3.各种条件转染均作复孔，结果经统计学处理，目的是排除孔间转染效率差异。是否还需要作共转染内参照？为了简便，大多数的研究者，如楼上所说，把LUCIFERASE的活性值除以beta-gal的值就行了。但理论上讲是应该将内源性的beta-Gal活性扣除的，对于哺乳细胞，内部是有此酶活性表达的。所以，要设一个孔，任何DNA都不转染，然后把所有的beta-gal活性值都减去这个阴性对照的数值，最后把这个值与LUCIFERASE的活性做比，求出的比值为LUCIFERASE基因前面PROMOTER的活性。 PROMEGA有一种试剂盒，做内参照的不用beta-gal,是另一种LUCIFERASE，用不同的底物。这种酶在细胞内没有内源性的表达，结果更可靠些。 这个beta-gal一定要加，因为它是衡量转染效率的。它可是告诉你，是十个DNA转进去了，还是一百个。如果没有这个衡量标准，转进去了一百个DNA的LUCI活性当然强，如果跟转进去十个的比高不了多少，那事实上LUCI前的PROMOTER活性还是低。如果没有这个标准就会得出错误的结论了。 减去背景beta-Gal的时候不可直接减，要换成（活性/毫克）再减，这样相当于每个细胞里减去背景。同样的道理，做比值的时候也要把A值换成（活性/毫克）再与beta-Gal比。 不知说明白了没有。总之感觉处理数据很困难。总体的趋势应该和两值直接比差别不大（在背景比较小的时候。有的细胞背景就是高）。有两种可能，一是LIPO对你的细胞毒性大，解决方法是五小时转染完成后，把转染混合液吸出，再加培养液。二是该细胞对你转染进去的质粒表达产物敏感，或是被诱导了APOPTOSIS，或是造成了DIFFERENTIATION，解决方法是换一种细胞，看这种现象是否发生MTT检测的是细胞的活性,即活细胞数的相对量,不可能用来检测转染效率.MTT检测最后细胞都碎裂,如何继续培养.可做三个平行孔,分别24.48 72小时检测.想做Western和，RT-PCR和流式的话，如果这些孔转染相同的质粒,当然可从其中几个孔的细胞做Western,再取另外几个孔的细胞作 RT-PCR，再取别的孔的细胞作流式？其实瞬转质粒的效果都不好,建议还是做稳定表达.可考虑以下原因：1.培养基必须在转染24小时前换用无双抗的。2.质粒虽然是按说明书提取的，但要看清楚质粒提取试剂盒是否可以去除内毒素。3.如果选用Invitrogen Lipofectamine 2000，它提供的参考步骤并不一定是你选用的培养板规格，须参照后面的列表4.培养板非常容易污染，必须排除微生物污染的可能5.可以考虑转染5小时左右吸去转染液体，换用含血清的培养基继续培养6.转染前你培养了多少时间？如果进行顺式转染，必须在细胞生长达到再进行转染个人认为你还可以考虑以下方面：1.请确认你的Lipofectamine 2000是否已经过期，经过我们实验室的实践：尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000，因为过了半年后，就算没有过失效期，但是细胞毒性大大增加，而转染效率却大大下降。2.确认你在使用Promega质粒提取试剂盒是使用了内毒素去除树脂（Endotoxin Removal Resin）。3.按照Promega质粒提取试剂盒的protocol，在第19步加入nuclease-free water后直接放入-20或-80度冻存就可以，我们没有另外沉淀。4.去除质粒提取中的酒精可以试用下面的方法：将Ep管倒置在灭菌的滤纸上，大概10-20分钟后就可以干了，注意不要时间过长，否则太干了，不太好溶解。5.你可以尝试适当减低转染试剂的用量，并在转染5小时时观察细胞情况，并且换10FBS的培养基，看看情况怎么样，因为转染液对细胞的损伤非常大。祝您实验成功！各种培养细胞或细胞株对转染试剂的毒性敏感程度不一样, 脂质体的毒性大一些, 如果是转染试剂的问题,建议使用毒性低一些的转染试剂,如阳离子聚合物转染试剂，可以试试梭华-sofast。/newsf/2003-9/B2003917143939.htm1.高质量的siRNA（或者是siRNA表达工具，比如质粒，PCR片断等）2.有效的转染试剂。如何选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。常见的转染试剂包括脂质体和多胺类的试剂，主要是为双链DNA转染而设计的。转染质粒DNA的最佳试剂往往不适合siRNA的转染，反之亦然。适合于质粒DNA转染用的转染试剂往往也不适合siRNA表达框（SECs: PCR fragments expressing siRNAs，参考RNAi：制备siRNAs的5种方法如何选择最适合你的方法）的转染。随着RNAi技术越来越受重视，各厂家纷纷推出了自己的RNAi转染试剂。一：siRNA专用转染试剂 （二：质粒和PCR片断专用转染试剂）产品名：RNAiFect Transfection Reagent厂家：Qiagen优点：高效低毒；适用细胞广泛；即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染，操作格外简单方便简介：siRNA的转染是基因沉默实验中关键的一步。RNAiFect是一种基于脂质的转染试剂，专门用于siRNA转染，确保没有RNAse活性。传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。由于RNAiFect的内毒素和细胞毒性都非常之低，加上转染复合物能够高效的在完全培养基中形成，因而整个转染过程可以在含血清而且是含有抗生素的培养基中操作，无需更换培养基，这极大的方便转染操作！该试剂可以耐受较高浓度的siRNA转染而不引起细胞毒性，能够得到更好的抑制效果，适用于包括AGS, HEK-293, HeLaS3, Huh-7, HUVEC, NIH-3T3, and mouse embryonic fibroblasts cells在内的多种真核细胞。操作流程： 1.用含有抗生素和血清的培养基，或者是附带的Buffer EC-R稀释siRNA 2.加入RNAiFect转染试剂，在室温下混合并孵育1015分钟 3.加入培养细胞中即可。2448小时后检测siRNA的干扰效果。 参考数据：HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6 x 104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturers protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit with primers targeted to lamin A/C and GAPDH. Expression of the lamin A/C gene was normalized to the expression of GAPDH and quantified using a standard curve prepared from known amounts of cDNA purified from HeLa-S3 cells. Cells were transfected and LDH activity in the cell culture supernatants was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturers protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed by detergent was set to 100%. Background LDH activity was measured in untransfected and untreated cells, and this value was subtracted from all other measurements. Name Details Cat. No. 价格 RNAiFect Transfection Reagent, 1ml RNAiFect Reagent 1ml and bufferEC-R, for up to 170 transfections in 24-well plates; up to 500 transfections in 96-well plates 301605 2501 操作手册：RNAiFect Transfection Reagent 操作手册产品名：TransMessenger Transfection Reagent厂家：Qiagen优点：高效转染；RNA专用即用型试剂；简介：TransMessenger是第一个专门为转染RNA而设计的非脂质体的脂质型的转染试剂。没有RNase活性，内毒素10 EU/ml，经严格设计去除所有可能降低RNA转染效率的成分，确保高效转染。独特的缓冲液促进RNA聚集，经脂质体包装成为高效转染复合物。适用于包括293, BSC-1, MA104, MRC, Primary cortical and hippocampal cells, TRM-6 and TRM-6/PDX-1 cells, TU7D, Vero在内的多种细胞。操作流程：将RNA和Enhancer R，Buffer EC-R室温混合5分钟，加入TransMessenger Reagent室温孵育510分钟，加入培养基混合后加入细胞中，再温育培养3小时，更换培养基继续培养直到检测。操作手册TransMessenger Transfection Reagent Handbook (PDF version, 83 K产品名：The Silencer siRNA Transfection Kit: siPORT Amine 和 siPORT Lipid 厂家：Ambion 优点：专为siRNA转染不同细胞类型而设计简介：目前主流的转染试剂类型主要是脂质类和多胺类两种，由于不同的细胞“偏爱”不同类型的转染试剂，因而对不同的细胞株的转染效率可能大相径庭，另外转染效率也和被转染的大分子类型有关（dsDNA, RNA, dsRNA, Oligo.）。siPORT Amine (a polyamine mixture) 和 siPORT Lipid (a mixture of cationic and neutral lipids)是专门为siRNA转染哺乳动物细胞而设计的。正如前面提到的，两种不同的类型对不同的细胞株有不同的表现：例如 siPORT Lipid 转染Hela的效率明显更高，而 siPORT Amine 更适合转染293细胞。两种转染试剂的细胞毒性都很低，非常适合转染包括化学合成的siRNA，以及体外转录或者长片断双链RNA由RNAseIII/Dicer酶降解制备的siRNA库在内的小分子RNA。The Silencer siRNA Transfection Kit中分别提供了这两种不同类型的转染试剂，方便实验人员在遇到各种细胞株时都可以分别尝试两种试剂，找到最适合的转染产品和方法，因而适用范围更宽。另外试剂盒提供针对GAPDH的siRNA的正负对照，用来检测转染的情况，比较适合初次使用。试剂盒的组分也有单独提供的。操作流程：用OPTI-MEM I reduced serum medium（Gibco）培养基稀释转染试剂，室温孵育1030分钟，加入siRNA，再室温孵育1520分钟。（洗细胞）加入培养细胞中，4小时后加普通培养基(e.g. DMEM with 10% FBS)继续培养直到检测。 Figure 4. Delivery of siRNA by siPORT Lipid and siPORT Amine Induces RNAi. The indicated cell types were transfected with GAPDH siRNA or negative control siRNA using either siPORT Amine or siPORT Lipid Transfection Agent. Bars indicate gene expression levels 48 hours after delivery of the gene-specific siRNA relative to negative control wells.订货信息（点击产品名可以直接在生物通商城订货）：产品名（点击可直接定购） 用量 货号 价格 Silencer Transfection Kit 每种0.4ml，24孔板可做200次转化以上 1630 5987 siPORT Amine Transfection Reagent 0.4ml，24孔板可做200次转化以上，或者6孔板100次转化以上 4502 2783 siPORT Lipid Transfection Reagent 0.4ml，24孔板可做200次转化以上，或者6孔板100次转化以上 4504 1602 产品名： GeneEraser siRNA Transfection Reagent厂家：Stratagene优点：专门为siRNA转染多种细胞而设计，高效转染，只需低浓度siRNA；毒性更小，操作简便；简介: RNAi实验要求专门为siRNA转染而优化的转染试剂，GeneEraser正是这样一个产品，可以高效直接将siRNA运送到细胞质中以便和mRNA结合并引发mRNA降解，只需要很低浓度的siRNA就可以使特定的基因表达沉默。在Hela细胞中的转染效率可高达95%100%。相比很多阳离子脂质体转染试剂，GeneEraaser低毒性可以显著减少对细胞的伤害。适用于包括CHO-K1，NIH/3T3，HT-29，A549，293，Hela，Monkey Kidney在内的多种细胞。可以在有血清的培养基中转染，无需更换培养基。操作流程：用无血清培养基稀释GeneEraser，室温孵育515分钟，加入siRNA再室温孵育515分钟；将转染复合物加入刚刚更换新鲜培养基(含血清)的细胞中，继续培养直到检测。操作手册：GeneEraser siRNA Transfection Reagent手册*产品名：Lipofectamine 2000 Transfection Reagent厂家： Invitrogen优点：高效低毒，耐血清，易于操作，适用范围广简介：Lipofectamine 2000是Invitrogen公司著名的DNA转染试剂，在RNAi技术日益普及的今天，Invitrogen公司特地为其推出适用于siRNA转染的Protocol，使之同样能高效转染siRNA。两个关键性特点使得LIPOFECTAMINE 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，以及（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂。适用于包括HEK 293, BHK, CHO-K1,和A549在内的多种细胞。操作流程：用无血清培养基分别稀释siRNA（20pmol）和Lipofectamine 2000，室温孵育5分钟后，混合，继续孵育20分钟，直接加入培养细胞中，继续培养直到检测。操作手册：Lipofectamine 2000 Transfection Reagent用于siRNA转染的流程*产品名：RiboJuice siRNA Transfection Reagent 厂家：Novagen简介：专门为siRNA转染优化设计的转染试剂，高效转染，低毒设计，适用于包括Neuro-2A， BHK，COS-7，MCF-7，NIH，3T3，A549，HeLa，HEK293，CHO，HepG2，L6在内的多种细胞。还可以和DNA转染试剂一起实现siRNA和DNA质粒的共转染，便于衡量转染效果。操作流程：无血清培养基稀释RiboJuice，静置5分钟后加入siRNA，孵育515分钟后直接加入培养细胞中，继续培养直到检测操作手册：RiboJuice siRNA Transfection Reagent操作手册*据厂家资料显示可以做RNA和Oligo转染还有不少产品，包括：罗氏公司的Fugene 6（这也曾是本人至爱）和DOTAP转染试剂， Promega公司的TransFast和Tfx，Transfetam转染试剂，Invitrogen公司可以用于转染RNA的DMRIE-C转染试剂，和转染寡核苷酸专用的Oligofectamine，也可以用于RNAi实验，但是很遗憾，由于资料不全，没有找到这些产品用于RNAi实验的具体应用，所以我们在此暂时不作介绍。二、siRNA构建质粒和PCR片断转染试剂产品名：siPORT XP-1 厂家：Ambion简介：号称是RNA公司，也是最早投身RNAi领域并致力生产和推广RNAi相关技术和产品的Ambion公司，率先推出商品化的siRNA表达质粒（可以通过质粒方便的在细胞内表达siRNA）和PCR产物直接转染细胞制备siRNA的方法，同时也为这两种方法提供了专用于siRNA构建质粒和PCR片断的转染试剂siPORT XP-1。这个多胺类的转染试剂毒性低，易于使用，能够在有血清的条件下高效的将质粒DNA或者PCR片断转到哺乳动物细胞，不需要更换培养基。多数质粒转染试剂不适合较短的线性DNA的转染，而XP-1是专为SECs和PCR产物转染优化设计的，结果更有保证。Figure 3. SECs Delivered with siPORT XP-1 Induce Gene Silencing. siRNA Expression Cassettes (SECs) were prepared with the Silencer Express (Mouse U6) siRNA Expression Cassette Kit and then transfected into HepG2, COS-7, MCF-7, HeLa, and DU145 cells with siPORT XP-1. Gene silencing effects were monitored by Northern blot 72 hours after transfection. Figure 3 shows the use of siPORT XP-1 for transfecting SECs targeting GAPDH into five different cell lines. GAPDH mRNA levels were reduced by 90% in three of the five cell lines, and 75% in the remaining two.( pSilencer 2.0-U6 was engineered to express an siRNA to GAPDH and then transfected into COS-7, HeLa and DU145 cells with siPORT XP-1. 72 hours after transfection, RNA was isolated and GAPDH mRNA levels were analyzed by Northern blot 操作流程：无血清培养基稀释转染试剂，静置5-20分钟后加入DNA或者PCR片断，孵育520分钟后直接加入培养细胞中，继续培养直到检测。操作手册：siPORT XP-1操作手册产品 货号 描述 siPORT XP-1 （0.4ml） 4605 24孔板转染可用200次以上 在本次测评中综合指数没有转染效率一项，原因是根据各厂家的阐述很难评出其差别，siRNA抑制基因表达本来就是一个和试剂量有关的过程，不同的细胞株，不同基因，不同的siRNA和不同的siRNA量，不同的操作都会影响实验的结果。有的转染试剂“耐受”RNA少，或者说载量较小，要增加siRNA的量就要相应增加转染试剂的量，影响转染，有的试剂可以承载较多的RNA，容易得到较好的结果，因而难以客观的评价。很少有实验室能有机会“用遍”各种产品。不过不同的实验室会选择不同的产品，有自己的使用心得，如果能将这些心得汇集起来，对于后来的新手将是非常实用的参考。要成功的进行siRNA的转染实验，除了要选择适合的转染试剂外，还需要对实验条件进行优化，包括siRNA浓度，质量，细胞密度，血清的浓度以及转染试剂的量可能你某个环节有污染，或者脂质体，或者质粒，或者培养基，最后就是你的器皿和操作。首先你要排除这些问题，你应该做对照，就是单加质粒，单加脂质体，单加培养基，最后器皿全部重新消毒。这样子观察几个小时就可以知道是哪个物质加进去后会导致细胞死掉。其次，你转染后一般4个小时就可以了，不要太长时间，还有我一个同学总结的经验是加脂质体的过程中，要每加一点就混匀一下，这样子，对细胞的损害小些。试试吧，看能否解决你的问题。首先，转染细胞用的质粒必需保证无菌，一般的质粒提取试剂盒都不能做到这一点，我们通常都会将提完质粒后或者提的最后一步，用75乙醇沉淀，这样就除菌了，离心后，再在超净台打开，用无菌水之类溶了，这应该是最常见的做法了。其次，现在一般脂质体如lipo2000都是建议带血清转的，毒性很小，大多数转染导致的毒性都是提质粒带的大肠杆菌裂解出来的内毒素，者这对原代细胞会产生很大的影响，而你提到的MDA-MB-231,Bcap-37,MCF-7三个都是细胞系，对内毒素不敏感，我转MCF-7随便用哪个盒子都能活的很好。现在也有不少公司，比如Qiagen，天为时代，卖的试剂盒都是去内毒素的，这样的试剂盒对转原代比较好。1、 保证细胞活力最好 2、如果条件允许的话加点优胎血清 3、可以考虑置换培养掖 4、质粒纯度 5、质粒的比例可以考虑适当减低，因为一般来讲，质粒是够的 6、两种质粒的比例要摸，另外，egfp要在24-48小时之后才大量出现，并且有一个表达期 哪位朋友知道有什么好的关于转染的资料或者网站么？相关网站： /products/transfection/index.shtml /products/families/index.shtml /catalog/country_select.asp?/transfectionasst/Default.htm&ckt=2 /catalog/country_select.asp?/tbs/tm012/tm012.html&ckt=2 http:/www.westburg.nl/htm/products/transfection/trans_main.htm /catalog/transfection/ /profiles/transfection/ /otherproducts/transfection1.htmLipofectamine 2000具有较强的细胞毒性。如果是细胞系转染，建议在加入Lipofectamine 2000后2-4小时换液，往往能取得不错的结果。另外厂家推荐的转染试剂使用量似乎偏高，建议少用。 转染时用无血清无抗生素的1640培养液是正确的，关键是你转染的时间太长了，一般情况在转染后4到6小时，应去掉转染试剂，加入含有血清的1640继续培养24 小时，这样才能继续后面的实验，Lipofectamine 2000还是很好用的。你可同时做个对照组，转染一个荧光蛋白进去，观察转染的效率！MCF7很好转，转个5，6K的质粒效率都很高1 ）用lipo2000转,转染前细胞状态一定要好，lipo2000也不是一定只转增殖细胞，但是在转染前几个小时换个液刺激一下是个不错的主意。2） 我用lipo2000转染大多数细胞的经验是有血清比无血清要好，你可以自己去试。3） 关于换液的问题，像MCF7之类的细胞系对质粒带的内毒素都不太敏感，lipo确实有那么点毒性，减半不会显著降低效率。而我对这类细胞从来都不换液，因为没差别。4） 效率低可能的原因很多。就质粒而言，质量一般问题不大，主要是量的问题，不知你定量准不准，如果加大质粒量能提高效率，那么有可能你的质粒纯度不行，影响读数，这里就不多说了。1 细胞瞬时转染后,有关转染效率的检测指标有那些?1 我是用pEGFP-N1质粒转染细胞36小时后，将细胞固定后用DAPI染细胞核，然后荧光显微镜下观察并照相。细胞瞬时转染效率=EGFP阳性细胞数/DAPI阳性细胞核数。取5个视野均值用来估计细胞瞬时转染效率。2 应该不会，没有看到相关报道3 为什么不直接测量目的基因？如果你用的细胞瞬时转染效率不高，最好通过筛选建立稳定转染细胞系。 用绿色萤光蛋白载体是否可以共同携带目的基因和-myc.以便转染后用-myc的抗体就可以验证目的基因的转染量（而不用特异而专一的目的基因的抗体）如果做稳定转染，建议你不要直接做相关指标检测！一般是在转染后一定时间（具体时间与你转染试剂和筛选基因所表达的蛋白时间相关，我的是G418筛选，4872小时），按一定的比例吧转染后的细胞分六孔板（具体比例与细胞生长情况和转染效率有关，由预试验而定）进行加药筛选！（筛选浓度预实验定）挑选单克隆，并且加药维持筛选（维持浓度为其筛选浓度一半），然后24孔板、6孔板、培养瓶扩大培养。挑选单克隆后，选多个单克隆就可以做下一步的试验了！至于转染时间和质粒剂量，首先看看说明书，其应该有个明确的范围，然后你在其中做几个浓度，做一下预试验！GOOD LUCK！首先得明确OD260/OD280比值的意义DNA在1.8最纯，一般在1.6-1.8都是可以接受的，如果大于1.8的话，说明可能有RNA的污染我个人觉得，由于提取质粒的时候加过RNA酶，所以存在RNA污染的几率不大，DNA最后的吸光度比值在1.6-1.8更可信一些。而且，关键是转染用质粒的DNA浓度，是用OD260转换出来的，浓度高一些，经验上转染效率会相对更好一些。组成核酸分子的碱基，均具有一定的 吸收紫外线的特性，最大吸收值在波长为250270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外吸收值在260.5nm,胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.4nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖，磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡聚核苷酸为20ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光度法可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。我也是从书上找来的，共同学习！分子克隆上有相关的说明.真核转染要求DNA的质量体现在OD260/OD280的比值,还要求最好为超螺旋.也有的文献说dna线性化之后,转染的效率会提高.数量体现在OD260值上.所以真核转染影响因素还是挺多的，OD260/OD280也只是其中之一。还有一点就是做转染的时候，一般都会选择试剂盒进行抽提，保证DNA的纯度以及量；还有就是去除内毒素。但是我们用普通的碱裂解法，经过二次酚氯抽提得到的DNA样品，进行转染，效果一样不错。所以试验这个东西恐怕和楼主的感觉一样：仁者见仁,智者见智吧。呵呵转染用的质粒首先要保证数量，一般为2微克以上。其次是你的质粒大小，如果是较小的质粒，你可以直接用华舜的试剂合抽提，如果你的质粒大于1万bp的话，就要用酚/氯仿/氯仿抽提。第三你的细胞如何，一般在细胞融合到70%左右转染细胞最好，贴补细胞悬浮的较少。第四，你的脂质体用量不要太大，在转染前要先用无血清的培养液冲洗和孵育。一定要在无血清的环境中转染，在四个小时后悬浮细胞较少的话一定要换培养液。含有什么问题再讲。可以先用RT-PCR试一下，不过不到10%的转染率要想在蛋白水平上有所改变，估计够呛，进行下一步的功能测定几乎不太可能。以前我转染悬浮的血液肿瘤细胞效率大概差一点20%，G418筛选效果还可以，我觉得你可以筛选试一下，如果你的有荧光表达可以用流式筛选，效果应该更好。质粒转化感受态细菌质粒转染细胞病毒感染细胞转染(transfection):1.感受态细菌细胞受无外壳的噬菌体DNA的感染,发生转化作用,然后产生忧感染性的噬菌体.只是DNA而无蛋白衣壳参与.2.在组织培养中,指外源DNA被引入真核细胞.转导(transduction):通过噬菌体将供体的细胞的DNA转到受体细胞而因其基因重组作用转化(transformation):受体细胞的染色体中嵌入一段外源DNA而产生的具有重组作用.1. 转染(transfection):指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程.进入细胞的外源DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中也可以在染色体外存在和表达.2.转化(transformation):指质粒或其他外源DNA导入处于感受态的受体细胞并使其获得新的表型的过程.3.转导(transduction):由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程称为转导.2. 进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）准备真核表达载体将目的基因插入表达载体中转染筛选鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、试剂准备1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5-端分别引入酶切位点BamH和Xho，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5，质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二） 真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamH和Xho双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5质粒制备BamH和Xho双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。 2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度 培养板大小 生长面积（cm2） 大约细胞数 培养基容积（ml组织培养皿（60mm） 28 66105 5-6 6孔培养板（35mm） 9.5 3. 0105 1-2 12孔培养板22.6mm） 4 13105 05-1 24孔培养板（8mm） 0.5 06105 025-053. 真核转染 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：（1） 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。（2） 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。（3） 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。（4） 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。（5） 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。（6） 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为mRNA的基因组序列得到表达。（7） 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）准备真核表达载体将目的基因插入表达载体中转染筛选鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、试剂准备1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5-端分别引入酶切位点BamH和Xho，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5，质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二） 真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamH和Xho双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5质粒制备BamH和Xho双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。 2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度 培养板大小 生长面积（cm2） 大约细胞数 培养基容积（ml） 组织培养皿（60mm） 28 66105 5-6 6孔培养板（35mm） 9.5 3105 1-2 12孔培养板22.6mm） 4 13105 05-1 24孔培养板（8mm） 05 06105 025-05 3、 SHG-44细胞的转染：(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。(2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。 溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5g到总体积50l（30g/ml）。溶液B：用HBS稀释6l脂质体到终容积50l（120g/ml）。混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。(3) 不要移去培养基，逐滴加入100l脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。(4) 37孵育6hr。(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vec