益生菌发酵中草药对鲤鱼生长指标的影响.doc

益生菌发酵中草药对鲤鱼生长指标、生化指标及抗病力的影响摘 要 试验旨在研究发酵中草药对鲤鱼生长指标、生化指标及抗病力的影响。选取平均体重为 555g 的健康鲤鱼，随机分为 4 组 ( 对照组、中草药组、芽孢菌发酵中草药组、酵母菌发酵中草药组 )，每组 2 个重复，每个重复16 尾鱼，试验周期为 42d。结果表明，发酵中草药对鲤鱼生长指标虽无显著影响，但与对照组相比，添加芽孢菌发酵中草药组效果最好 ；溶菌酶活力显著高于对照组 (P 0.05)。用嗜水气单胞菌对鲤鱼进行攻毒的试验结果表明，添加发酵中草药可以显著降低鲤鱼的死亡率，相对中草药组免疫保护率提高 40%。关键词 发酵中草药 ；鲤鱼 ；抗病力Abstract The effects of the fermented Chinese herbs on growth index, biochemical index and disease resistance ofcommon carp were studied in this experiment. Healthy common carp with an average body weight of (555)g was randomlydivided into 4 groups (blank control, herbal compound group, bacillus fermentation group, yeast fermentation group). Theexperiment lasted 42d and carried out twice with 16 fish in each group. The results showed as follows :The fermented Chineseherb had no significant effect on the growth index, but compared with blank control group, The bacillus fermentation groupshowed the best result with significant higher serum lysozyme level than the blank control (P 0.05). The result of Theexperiment with aeromonas hydrophila to common carp for challenge showed that, fermentation group had lower mortalitythan herbal compound groups with 40% higher RPS.Keywords fermented Chinese herb; common carp; disease resistance中图分类号 ：S816.73 文献标识码 ：A 文章编号 ：1006-6314(2013)05-0031-04杆菌，显著提高了草鱼的免疫和抗氧化功能，进而促进草鱼的生长。中草药通过微生物的发酵作用，既可以增强中草药的效果，还可以减少中草药的用药量，同时兼具益生菌的辅助功效7，具有重要的经济价值和现实意义，非常值得研究和应用。冯志华等8用地衣芽孢杆菌C2-13 发酵红花，结果显示，红花酚羟基的数量大幅提高。吴志勇等9通讯作者 ：李丕武，副教授，硕士生导师。收稿日期 ：2013-3-22。32将黄芪发酵，可以大大提高黄芪多糖的含量，卫生部药品检验所试验表明，发酵中药只需要 1/28 的量，便可与普通水提物 1 份的量发挥等同药效。因此，本研究拟通过在饲料中添加发酵前后的中草药制剂，探讨投喂发酵中草药制剂对鲤鱼生长、生化及抗病力的影响，为发酵中草药在水产养殖业中的应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验用鱼 鲤鱼鱼种购自泰安温泉鱼苗厂，平均体重 (555)g。1.1.2 试验中草药 黄芪、当归、枸杞等均购自泰安市漱玉大药房，烘干、粉碎、过 60 目筛，冷藏备用。1.1.3 试验用饲料 饲喂基础饵料购买自通威饲料有限公司。1.1.4 攻毒菌株 攻毒试验用嗜水气单胞菌由山东农业大学提供。1.2 饲喂饲料的制作将各种中草药按照一定比例进行组方，分为对照组、中草药组、芽孢菌发酵中草药组、酵母菌发酵中草药组，共 4 组，每组设 1 个平行。称取中草药复方 5g，置于 250mL 三角瓶中，加入 50mL 蒸馏水，121灭菌 30min，配制成 10% 中草药复方的药液，按 2的药量添加到鲤鱼基础日粮中混匀，烘干备用。发酵组方需在药液灭菌后分别加入菌液，适合条件发酵后制备成药物饲料。1.3 试验动物饲养将鲤鱼鱼种暂养于室内玻璃水族 箱 (1m0.6m0.5m) 中， 有 效水体积为 220L。以充分曝气除氯的自来水作为循环水源，水温控制在(241)，24h 持续曝气充氧 ；日投喂量为鱼体重的 1.5%，早、中、晚定时投喂。经过 14d 的适应训练后将试验鱼按体重随机分为 8 个试验组，分别用药物饲料喂养，以投喂基础日粮为对照组，每组 16 尾，试验周期为 42d。1.4 样品采集测定1.4.1 生长指标 饲养试验结束后停喂 24h，空腹称取每组试验鱼的体重和体长，计算鱼体的生长指标。生长指标计算公式如下。增重率 (%)=( 末均重初均重 ) 初均重 100%肥满度 (%)=( 末体重体长3)100%饵料系数 = 摄食量 ( 终末总体重初始总体重 )脾脏指数 (%)=( 脾脏重体重 )100%肝体指数 (%)=( 肝胰脏重体重 )100%1.4.2 血清生化的测定方法 每组挑选体重均匀的 6 尾鱼，用 2.5mL 注射器静脉取血，4静置 2h，待凝血后用冷冻离心机 4下，4,000rpm 离心10min，分离血清，将血清分为 2 份，0.2mL 用于测定溶菌酶活性，0.5mL用于全自动生化分析仪 (KHB 卓越 330) 测定碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐。溶菌酶活性测定方法 ：用 0.1mol/L、pH 为 6.4 的磷酸钾盐缓冲液将溶壁微球菌配成一定浓度的菌悬液 (A570=0.3 0.5) 取 3mL，该悬液与 0.2mL血清与试管中混匀，测 570nm 初始光密度值 A0，后置于 37水浴 30min，取出后立即置于冰浴中 10min 终止反应，测 570nm 光密度值 A，水调零。溶菌酶活力 U=(A0-A) A1.4.3 免疫保护率试验 于饲喂试验结束后，采用嗜水气单胞菌 (1108cfu/mL) 对各组试验鱼进行攻毒。每组 11 尾鱼，腹腔注射 0.1mL 嗜水气单胞菌菌悬液。饲养观察 1 周后，统计各组的死亡率，并计算免疫保护率。死亡率 (%)=( 死亡鱼体尾数试验初鱼体尾数 )100%免疫保护率 (%)=(1- 试验组死亡率对照组死亡率 )100%1.5 数据统计分析试验数据采用平均值 标准差表示，采用 SPSS11.5 软件进行数据分析和统计，先对数据作单因素方差分析 (ANOVA)，若处理间差异显著，再用 Duncans 进行多重比较，显著性水平为 0.05。2 结果与分析2.1 发酵中草药对鲤鱼生长指标的影响表 1 发酵中草药对鲤鱼生长指标的影响组别 增重率（%） 饵料系数 肥满度（%） 脾脏指数 肝体比对照组 26.771.99 2.17 2.970.38 0.1710.02 1.7660.206中草药组 27.851.34 2.01 3.080.18 0.2210.019 1.4070.026芽孢菌发酵中草药组29.782.39 1.89 3.040.31 0.2430.048 1.4300.127酵母菌发酵中草药组27.070.14 2.04 2.600.14 0.1970.035 1.5810.19233中草药添加剂新研究由表 1 可知，添加发酵中草药制剂对鲤鱼增重率、饵料系数、肥满度无显著影响 (P 0.05)。与对照组相比，芽孢菌发酵组增重率提高 3.01%，饵料系数降低 0.28 ；与未发酵组相比，芽孢菌发酵组增重率提高 1.93%，饵料系数降低 0.12 ；试验组鲤鱼增重率、饵料系数、肥满度均高于对照组，但差异不显著。说明添加发酵中草药制剂可促进鲤鱼的生长指标，且优于中草药制剂组。2.2 发酵中草药对鲤鱼血液生化指标的影响由表 2 可知，中草药发酵制剂对谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐均无明显差异，但与对照组相比，发酵中草药添加组可降低鱼体内 ALT、AST、GRE 的含量，芽孢菌发酵中草药组溶菌酶活力显著高于对照组 (P 0.05)，碱性磷酸酶略低于中草药复方组。2.3 免疫保护率试验由表 3 可知，鲤鱼经嗜水气单胞菌攻毒，观察 1 周，对照组死亡率为90.9%，中草药制剂组死亡率 72.7%，免疫保护率 20% ；芽孢菌发酵中草药制剂组死亡率最低为 36.4%，免疫保护率达到 60% ；酵母菌发酵中草药制剂组为 54.5%，免疫保护率为 40%。说明添加发酵中草药制剂可以显著降低死亡率，提高免疫保护率。3 讨论3.1 发酵中草药对鲤鱼生长指标的影响中草药含有多种生物活性物质和天然营养物质，可以促进动物的新陈代谢和蛋白酶的合成，进而促进动物的生长发育，提高动物对营养物质的利用率，降低饵料系数。黄文庆等10以复合中草药制剂饲养罗非鱼 8 周。结果表明，与对照组相比，0.1% 和 0.4% 添加组增重率分别提高 3.61% 和4.09%，特定生长率均提高 3.36%，饲料系数均降低 4.5%(P0.05) ；邱小琮等5设计中草药配方和连续投喂异育银鲫 60d 后，能够极显著地影响异育银鲫的生长(P0.01)。李明等3选用的复方中草药 ( 黄芪、板蓝根、金银花和生石膏 ) 制成的添加剂达到了明显改善对虾生长的目的。试验结果表明，与对照组相比，添加芽孢菌发酵组增重率提高3.01%， 饵 料 系 数 降 低 0.28 ；与未发酵组相比，添加芽孢菌发酵组增重率提高 1.93%，饵料系数降低0.12 ；试验组鲤鱼增重率、饵料系数、肥满度均高于对照组，与前人研究结果相似。3.2 发酵中草药对鲤鱼生化指标的影响中草药作为一种免疫增强剂，含有多种复杂、有效的生物活性成分，在使用时能刺激非特异性免疫机制，进而增强水产动物的免疫应答能力。溶菌酶是非常重要的非特异性免疫指标，它在防御病原入侵上起着重要作用。溶菌酶活力的增大，可增加溶菌酶溶解细菌的能力。简纪常等11研究表明，添加中草药可以显著提高鲤鱼血液中 NBT 阳性细胞数和溶菌酶活性 (P0.05)。陈孝煊等12用 1% 的大黄、穿心莲、板蓝根和金银花等 4 种中草药提取物分别连续投喂异育银鲫 28d。结果表明，中草药提取物可显著提高异育银鲫的血液白细胞吞噬活性，溶菌酶的活性与对照组之间有极显著差异。本试验结果表明，与对照组相比，饲料中添加芽孢菌发酵中草药制剂可显著提高鲤鱼的溶菌酶活性 (P0.05)，与前人研究结果相似。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是广表 3 发酵中草药对鲤鱼抗病力的影响组别 攻毒鱼数量 死亡鱼数量 死亡率(%) 免疫保护率(%)对照组 11 10 90.9中草药组 11 8 72.7 20芽孢杆菌发酵中草药组11 4 36.4 60酵母菌发酵中草药组11 6 54.5 40表 2 发酵中草药对鲤鱼血液生化指标的影响组别LSZ(溶菌酶)AKP(碱性磷酸酶)ALT(谷丙转氨酶)AST(谷草转氨酶)GRE(肌酐)对照组 0.0490.0050a13.870.93a94.224.98a343.6829.38a37.536.85a中草药组 0.0570.0036a26.161.05a73.367.29a301.5325.51a31.313.64a芽孢杆菌发酵中草药组0.0720.0083b25.342.12a68.441.02a235.2516.55a28.875.14a酵母菌发酵中草药组0.0620.110a13.831.21a76.944.67a216.2042.27a35.275.46a注 ：同一列小写字母不同者差异显著 (P 0.05)，同一列小写字母相同者差异不显著 (P 0.05)，下表同。34泛存在于动物线粒体中的重要转氨酶，其活性变化是反应肝细胞受损的重要指标，还可以反应机体中毒或病理变化。孟兆娜等13研究发现，中草药对鱼血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶的活性有一定的降低诱导作用。陆鑫等14研究发现，随着饲料中草药含量的增加，转氨酶呈现先增加后下降的趋势，添加 0.2% 和0.4% 的复方中草药对尖吻鲈谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性有一定的降低诱导作用。本试验结果表明，添加发酵中草药制剂对谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性有很好的降低诱导作用，且发酵中草药组优于未发酵组。3.3 发酵中草药对鲤鱼抗病力的影响在饲料中添加中草药可增强鱼体的抗病防菌免疫保护力。刘冉等15研究表明，罗非鱼用嗜水气单胞菌攻毒，添加 1.5% 2.0% 复方中草药对于提高罗非鱼的抗病能力有良好的效果。本试验结果表明，鲤鱼经嗜水气单胞菌攻毒，观察 1 周，对照组死亡率为 90.9%，中草药制剂组死亡率 72.7%，免疫保护率 20% ；芽孢菌发酵中草药制剂组死亡率最低为 36.4%，免疫保护率达到 60% ；酵母菌发酵中草药制剂组为 54.5%，免疫保护率为 40%。说明发酵中草药制剂可以显著降低死亡率，提高免疫保护率。4 发酵中草药在水产养殖应用中的开发前景与展望抗生素类药物和化学药物的滥用制约着水产养殖业的健康发展，高效、低毒、安全的中草药添加剂的开发应用值得人们深入研究。发酵中草药一方面可以提高中草药药效，在水产养殖上减少使用量也可以达到较好的应用效果 ；另一方面微生物也可以起到促生长、促消化的作用，提高养殖效益。发酵中草药在水产养殖上可以发挥“少量、高效、安全”的优势，发展无公害水产饲料添加剂，生产绿色水产品，增强我国水产品的国际市场竞争力。中草药在我国水产养殖上的应用有深厚的基础，丰富的经验，在开发发酵中草药的过程中应结合不同水产动物的特性，筛选合适的中草药复方和发酵菌株，利用现代微生物知识进行合理发酵以开发新型的水产饲料添加剂。随着水产养殖业的快速发展，我国广大科技人员在科学实验和生产实验中的不懈努力，再利用中草药、微生物资源，开发发酵中草药，促进水产养殖业的发展，一定会取得突出的成绩。参考文献1 秦玉丽 , 刘松岩 . 中草药在无公害水产养殖中的应用研究 J. 河北农业科学 ,2007,1(5):71 72.2 苗英林 . 中草药对水产动物免疫功能的影响 J. 中国畜牧兽医文摘 ,2011,27(4):196.3 刘克琳 , 何明清 . 益生菌对鲤鱼免疫功能影响的研究 J. 饲料工业 ,2000,21(6):24 25.4 张照红 , 林旋 , 张伟妮 , 等 . 复方中草药对奥尼罗非鱼血液非特异性免疫功能的影响 J. 水产科学 ,2011,(1):1 5.5 邱小琮 , 周洪琪 , 刘小刚 , 等 . 中草药添加剂对异育银鲫生长和蛋白质消化吸收的影响