蛋白质组学Proteomics.doc

蛋白质组学Proteomics打？的答案表示不确定，没有标记的有些也不确定第一章HUGO：人类基因组组织（HUGO） 人类基因组计划（HGP）HUPO：人类蛋白质组研究组织(HUPO)1. 基因组学研究的成就、缺陷 1900 孟德尔遗传定律 1913 绘制出第一张线式基因图谱 1929 提出DNA的化学成分和基本结构2. 人类基因组计划“三大科技计划” 人类基因组计划，( 因其对预防治疗遗传疾病、破解人类遗传密码具有里程碑式的意义 ）与曼哈顿原子弹计划、阿波罗登月计划，被称为20世纪的人类自然科学史上三大科学计划。3. 人类基因组作图的目的：目的是保证人类整个基因组的完整性。都是根据人类社会发展 需要，为了更好的了解人类基因组成与预防某些未知领域的疾 病而做出的图解分析素材。4. 遗传图谱、物理图谱、基因组图谱这三个图谱之间的相关性 遗传图谱：采用遗传学分析的方法将基因或其他DNA分子标记在染色体相对位置上构建的连锁图。表示不同基因之间的相对位置，以及不同基因之间的相对距离！ 物理图谱：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定基因组的实际位置所构建的位置图。 遗传图谱与物理图谱的共同之处都是确定基因或DNA分子标记在染色体上的排列位置。 基因作图（gene mapping）是一种遗传学作图，用来定位染色体中特定的DNA片段。是基因组研究的成果之一，主要分为以重组率为定位依据的遗传舆图，以及以DNA片段实际位置为依据的物理舆图？5. 从几个方面看结构基因组学和功能基因组学？以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学。？6. 蛋白质组学与传统蛋白质化学的区别1 蛋白质组学研究与传统蛋白质化学研究不同。传统蛋白质的研究主要针对单个蛋白质。蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。（多蛋白质系统）2 蛋白质化学包括研究蛋白质的结构和功能，通常涉及物理生物化学或机械酶学，蛋白质组学的内容是系统生物学，而不是结构生物学。3 蛋白质化学研究工作通常包括完整序列测定、结构测定以及进行结构控制功能的模型研究；蛋白质组学需进行复杂混合物的分析，通过在数据库匹配工具下进行部分序列的测定。5. 蛋白质组学研究的目的：确定所有的蛋白质6. 蛋白质组学与基因组学研究技术上有什么区别？基因组学蛋白质组学环境静态动态数量少多能否扩增利用PCR扩增无法扩增检测技术利用互补链抗原抗体结合对象唯一不同实体7. 蛋白质组学研究的内容分为几个方面？主要哪几个方面，研究内容1 蛋白质的分离与鉴定2 蛋白质互作或蛋白质复合体分析3 蛋白质翻译后修饰研究4 蛋白质功能鉴定5 蛋白质复合体的结构分析第二章1. 蛋白质组学的三大分支：表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、结构蛋白质组学表达蛋白质组学研究技术：蛋白质分离技术、质谱分析技术、基因表达的系列分析技术、微测序而技术等功能蛋白质组学研究技术：生物信息学分析、全基因组的蛋白质标签、基因敲除或删除、酵母双杂交、蛋白质芯片等结构蛋白质组学研究技术：X射线晶体衍射图谱法（测定晶体中的蛋白质分子构象）、核磁共振法（测定溶液中的蛋白质构象）2. 蛋白质组学与基因组学的区别。1 蛋白质表达水平不能从mRNA表达水平来预测。2 蛋白质组与他的状态相对应。33. 上述区别的根本原因是蛋白质组学研究对象比基因组学研究更复杂，为什么？数量多、结构更为复杂、是动态反应发育过程1 蛋白质的组成及结构比基因更复杂；2 蛋白质的数目远大于基因的数目；3 基因是相对静态的，生物体中的基因组在不同环境下是相同的，而蛋白质是动态的，随时间、空间的变化而变化。3. 2-DE技术与4. 蛋白质组学三大支撑技术：2-DE技术、质谱鉴定技术、图像分析技术5. 2D-HPLC（多维液相色谱）色谱分离技术的优点，与2-DE的区别。定义：任何将混合物组分在两相中（固定相和流动相）进行分配的分离技术都被称为色谱。原理：混合物溶解在同一溶剂中，当流动相流经固定相时 ，混合物组分可以与溶剂以及固定相基质分子间发生作用。HPLC优点 ：（包含区别）1 速度快 几个小时可完成全部分离，而2-DE分离一般需要12d。2 自动化 由于在溶液状态样品处理方便、快速，避免了2DE从胶上回收样品的繁复操作，分析过程易于与质谱联接。3 多用途 对各种蛋白质均适用，而2DE对分子量过大(200kD)或过小(10kD)蛋白质不易分离。6. 1-DE电泳技术的优缺点优点：1 免除了样品从1D胶向2D胶过渡时的繁复操作。2 与准确、灵敏、高分辨的质谱鉴定技术相结合，可能发展成2-DE的替代方法之一。 缺点： 1 1-DE得到的分离度是相当有限的；2 在凝胶上的单一蛋白质条带实际上可能含有多种蛋白质；3 在胶上蛋白酶切和多肽序列的直接测定方面还存在一些问题。7. Edman降解（蛋白质测序方法）与Sanger测序法的不同 蛋白质N端测序-Edman降解法四个步骤：偶联、环化、裂解、转化Sanger试剂用于鉴定蛋白质和多肽的N末端氨基酸残基。Sanger测序是用于DNA的测序。Edman降解法才是氨基酸序列的测定技术。但是它不能测超过40个残基的序列。8. X晶体衍射与核磁共振（NMR）X晶体衍射气相扩散法NMR固相nmr，液相nmr第三章1. 什么叫电泳？电泳的载体分哪两大类？凝胶作为载体的特点 电泳技术就是由各种带电粒子在电场中迁移率不同而进行分离的一种技术。电泳的载体分凝胶电泳、有两性电解质的载体？凝胶作为载体的特点：1 孔径与蛋白质分子大小相近，而且具有制胶方便、易于显色、透明等优点，是双向凝胶电泳的首选支持介质。2 凝胶通过分子筛的作用增强了蛋白质迁移时依赖于分子大小的分离能力。2. 样品的制备包括哪几个过程细胞的破碎、裂解、蛋白质沉淀及杂质的去除3. 细胞破碎裂解获取蛋白质的方法，可以分为哪几类？1 根据工具的不同，细胞破碎分为：机械法（研磨法、组织捣碎法）、物理法（超声波处理法、反复冻融法、冷热交替法、压力杯法）、化学与生物化学法（有机溶剂处理法、酶解法、自溶法、渗透压冲击法）；2 根据破碎力度的不同，细胞破碎方法分为：温和的方法、剧烈的方法4. 样品制备过程中遵循的原则1 要保证蛋白质的完全溶解2 要避免蛋白质降解或丢失3 要去除杂质的干扰4 勿反复冻融以制备好的样品5. 蛋白质沉淀的方法：盐析法、有机溶剂沉淀法（三氯醋酸（TCA）沉淀法、丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法、苯酚提取法）、聚乙二醇沉淀法6. 蛋白质裂解的buffer包括哪几个方面？1 变性剂:改变溶液离子强度和pH值，破坏蛋白质与蛋白质之间的相互作用；通过改变溶液中的氢键，破坏蛋白质的二级结构和三级结构，使蛋白质充分伸展。2 表面活性剂：有助溶、变性和保护蛋白质的作用3 还原剂：破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质处于还原状态4 载体两性电解质：屏蔽蛋白质分子表面的疏水基团，增加蛋白质分子的溶解度；阻止蛋白质样品和IPG胶条中固相化的两性电解质发生相互作用5 蛋白酶抑制剂：避免细胞破碎后细胞自身的蛋白质水解酶被释放出来并被激活，导致蛋白质组成分变得更加发杂7. 2-DE中第一相要避免出现哪些问题？重复性差、阴极漂移？8. 样品提取中有不同的杂质，不同杂质用什么去除?1 核酸沉淀法去除核酸：去除核酸常用方法是用核酸内切酶进行降解2 有机溶剂沉淀法去除杂质：1) 多糖 超速离心法2) 脂类 丙酮沉淀，此外，蛋白质裂解液的变性剂也可减少蛋白质与脂类的结合3) 次生代谢物或磷脂 TCA/丙酮沉淀3 抑制剂去除多酚类物质 4 透析法去除盐离子和外源性带电小分子9. 分级提取和亚细胞提取的策略、区别10. 2-DE代表的含义蛋白质双向电泳技术：Two-dimension electrophoresis11. 2-DE凝胶配备中有两个参数，这两个参数跟什么有关？（书P61）两个参数是T（胶浓度）和C（N，N-甲叉双丙烯酰胺占两个单体总含量的百分比）这两个参数和凝胶孔径大小有关。一般来说，T增加时凝胶孔径变小。12. 2-DE一维和二维电泳的原理 蛋白质双向电泳的第一向通常是等电聚焦-根据不同蛋白质分子所带电荷量的差异，以等电点聚焦技术进行分离（蛋白质的等电点）。该原理基于2个前提-蛋白质是两性电解质；载体两性电解质所形成的连续pH梯度 二维电泳-根据蛋白质的相对分子质量大小不同，通过SDS凝胶电泳进行分离，相对分子量大的跑的快。13. 从一相到二相中间经过什么过程-平衡过程；平衡液包括哪几个组分，作用是什么DTT和beta-巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键保持欢迎状态，有利于SDS和蛋白质的充分结合，从而在SDS-PAGE时电泳能顺利进行。平衡缓冲液包括6 M 尿素和30% 甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT 烷基化。14. 2-DE染色有哪几种方法？区别和优缺点1 考马斯亮蓝染色：较准确地定量，能与质谱兼容；大多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝 染色，染色时间较长2 银染：灵敏度较高；线性差，与质谱不兼容，试剂盒价格昂贵3 负染：提高PAGE胶上蛋白质的回收率，可与质谱兼容；定量不够准确4 荧光染色：对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，灵敏度与银染相当，线性范围 高于银染；价格昂贵，需要价格不菲的荧光扫描仪检测信号15. 什么叫胶上酶解？酶解常用的酶有哪几种？为什么用有双识别位点的酶来切？胶上酶解：胶上的蛋白质不需要脱离胶体可直接把含有蛋白质样品的胶体放在溶液里进行酶解。 酶解常用的酶：胰蛋白酶、Glu-C（V8蛋白酶）为什么用有双识别位点的酶来切16. 2-DE方法中存在的一些问题？P601 低丰度蛋白质点的检测2 极酸和极碱性蛋白质的分离3 高分子质量蛋白质的分离17. 在PAGE中加入SDS和BETA-巯基乙醇的作用 SDS-一种很强的阴离子表面活性剂，可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂BETA-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。18. 蛋白质组学的研究流程：细胞的破碎、裂解、蛋白质沉淀及杂质的去除第四章1. 生物质谱仪组成三部分？每部分起什么作用 质谱技术的原理：将样本分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异来分离并检测离子的相对分子质量。1 离子化源：将肽段转化为离子2 质量分析器：根据离子的质量/电荷比（m/z）的不同来分离离子3 离子检测器：检测质量分析器分离后的不同离子2. 质谱性能用三个参数来描述（关键性能指标）：灵敏度、分辨率、质量精确性3. 质谱技术两种电离技术 基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）、电喷雾离子化质谱（ESI）4. MALDI是什么的简写：基质辅助激光解吸电离（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization）5. 基质所起的作用：防止肽段聚集；作为质子化试剂；吸收激光防止肽段破碎。6. 337nm脉冲光作用：让基质吸收光的脉冲能量防止离子化；让基质瞬间被脉冲，防止肽段讲解破碎。7. MALDI-TOF原理，几种不同的模式，为什么线型TOF带有误差原理：TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比。模式：线性模式、反射器模式、延迟提取模式线性模式带有误差：用连续提取离子的线性模式，TOF仪器的质量分辨率和测量准确度相对较低，测量误差在2%左右，这是由相同质荷比m/z的离子从加速器进入TOF质量分析器时的速度不同造成的，即“非公平起始”。初速度不同，相同质荷比的离子到达的时间不同。8. MALDI-TOF-MS内部组成信息，源后衰变（PSD）原理是指在MALDI离子源中产生的离子（母离子）在飞行管道飞行过程中可能发生裂解，分解为中性碎片和子离子。9. TOF里的时间跟什么有关：飞行时间与离子m/z的平方根成正比10. ESI让肽段带上电的原理蛋白质溶液通过高压电针，弥散成带电液滴形成的细雾。周围的溶剂分子很快蒸发，带电的大分子被完整的吸入气相。在穿过电针时加入的质子是大分子带上了额外的电荷。11. ESI和MALDI两种技术的区别1 MALDI只能让肽段带一个电荷，ESI让肽段带上多电荷层。2 MALDI是样品跟基质混合，在结晶状态下发生电离，ESI是让样品在溶液中就可发生电离。3 离子源方法不同，即让肽段带上电的方式不同。4 MALDI获得的是肽段质量指纹图谱的信息，ESI获得的是每个肽段中氨基酸的组成信息。12. 碰撞诱导电离（CID）获得肽段内部组成信息的原理13. MALDI-TOF-MS获得什么信息MALDI获得的是肽段质量指纹图谱的信息14. PSD、PSM两个信息有什么区别第五章1. 常见的有哪些蛋白质翻译后修饰蛋