木质素降解研究.doc

安徽理工大学毕业论文本科毕业论文木质素降解的研究LIGINI DEGRADATION OF RESEARCH 学院（部）： 化学工程学院 专业班级： 学生姓名： 指导教师： 2012 年 3 月 26 日2木质素降解的研究 摘要 评 述 了 木 质 生 物 降 解 的 最 新 研 究 进 展 ，主 要 包 括 木 质 素 的 生 物 降 解 机 制 、降 解 木 质 素 的 微 生 物 种 类 及 其 产 生 的 相 关酶 类 、微 生 物 的 代 谢 调 控 和 分 子 生 物 学 。 此 外 ，对 木 质 素 降 解 生 物 的 实 际 应 用 和 应 用 前 景 也 进 行 了 评 论。 关键词：木 质 素 ；生 物 降 解 ；秸 杆 ；白 腐 真 菌 ；环 境 保 护LIGINI DEGRADATION OF RESEARCHABSTRACTThe quality of the wood that the solution of the born down new grind investigate into the exhibition, The Lord will including wood grain life quality that machine system, drop down solution of grain of wood solution microscopic things kind of class and its production was born of enzyme in close, microscopic content of the generation x the control and points the son born to learn things. The outside, to wood quality grain drop solution which shall be born of border with and should be before using the scene also into the line evaluation theory.KEYWORDS：wood qualitative element; Born content drop solution; Straw pole; White-rot fungus really; The environment the care目 录摘要- 2 -绪 论- 1 -1简介- 2 -1.1基本概念- 2 -1.2单体与结构- 3 -1.3发展前景- 3 -2.木质素的降解简略- 4 -2.1概况- 4 -2.2木质素的结构特点- 4 -3.木质素降解微生物的种类- 5 -3.1三种重要木质素降解酶- 5 -I木质素过氧化物酶(LiP)- 5 -II锰过氧化物酶(MnP)- 7 -III漆酶- 9 -3.2 三种木质素降解酶协同作用- 10 -4 应用全景- 10 -4.1 木质素降解酶的全景- 10 -4.2 木质素降解酶的特性- 12 -4.3 木质素的降解微生物的酶活性调控机理- 13 -4.4 木质素的生物降解的应用- 16 -结 论- 17 -参考文献- 18 -谢 辞2绪 论 木质素资源十分丰富，是植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的有机化合物，估计全球的木质素年产量可达1500 亿t。然而，木质素资源并没有得到有效的利用，大量的木质素作为造纸工业的副产物而排放，不仅是资源的一大浪费，而且严重污染环境。采用物理和化学处理法，可减少约50% 的木质素排放，但治理成本高，易造成二次污染。利用生物技术降解木质素，可以减少环境污染，变废为宝，实现资源再利用。因此，认识木质素的结构特点和了解其生物降解的研究进展，对于木质素资源的合理化利用将具有一定的指导意义。 1简介1.1基本概念 木质素（lignin）是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤维的作用。其组成与性质比较复杂，并具有极强的活性。不能被动物所消化，在土壤中能转化成腐殖质。如果简单定义木质素的话，可以认为木质素是对羟基肉桂醇类的酶脱氢聚合物。它含有一定量的甲氧基，并有某些特性反应。木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物(纤维素是第一位)。 1.2单体与结构木质素单体的分子结构木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。因单体不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素（syringyl lignin，S-木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素（guajacyl lignin，G-木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyl lignin，H-木质素）；裸子植物主要为愈创木基木质素（G），双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素（G-S），单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（G-S-H）。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定显色反应（加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色）的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则很少见含有。一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中。其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外。1.3发展前景随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入 ,天然高分子所具有的可再生、可降解等性质日益受到重视。废弃物的资源化与可再生资源的利用 ,是当代经济与社会发展的重大课题 ,也是对当代科学技术提出的新要求。在自然界中 ,木质素的储量仅次于纤维素 ,而且每年都以500 亿吨的速度再生。制浆造纸工业每年要从植物中分离出大约 1.4 亿吨纤维素 ,同时得到 5000万吨左右的木质素副产品,但迄今为止 ,超过95 %的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉 ,很少得到有效利用。化石能源的日益枯竭、木质素的丰富储量、木质素科学的飞速发展决定木质素的经济效益的可持续发展性。木质素成本较低，木质素及其衍生物具有多种功能性，可作为分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂，木质素对人类可持续发展最为重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，其应用前景十分广阔。研究木质素性能和结构的关系，利用木质素制造可降解、可再生的聚合物。木质素的物化性能和加工性能、工艺成为目前木质素研究的障碍。2.木质素的降解简略2.1概况 绿 色 植 物 占 地 球 陆 地 生 物 量 的 95% ，其 化 学 物 质 组 成 主 要 是 木 质 素 、纤 维 素 和 半 纤 维 素 ，它 们 占 植 物干 重 的 比 率 分 别 为15%20% 和20% 。农 作 物 秸 杆 是 这 类 生 物 质 资 源 的 重 要 组 成 部 分 ，全 世 界 年产 量 为20 多 亿 吨 ，而 我 国 为 5 亿 多吨 。 但 是 ，要 充 分 、有 效 地 利 用 这 类 资 源 却 相 当 困 难 ，这 是 由 于 秸 秆 产 量随 季 节 变 化 ，且 量 大 、低 值 、体 积 大 、不 便 运 输 ，大 多 数 动 物 都 不 能 消 化 其 木 质 纤 维 素 ，自 然 降 解 过 程 又 极 其缓 慢 ，导 致 大 部 分 秸 秆 以 堆 积 、荒 烧 等 形 式 直 接 倾 入 环 境 ，造 成 极 大 的 环 境 污 染 和 浪 费。 存 在 于 秸 秆 中 的 非 水 溶 性 木 质 纤 维 素 很 难 被 酸 和 酶 水 解 ，主 要 是 因 纤 维 素 的 结 晶 度 、聚 合 度 以 及 环 绕着 纤 维 素 与 半 纤 维 素 缔 合 的 木 质 素 鞘 所致。 木 质 素 与 半 纤 维 素 以 共 价 键 形 式 结 合 ，将 纤 维 素 分 子 包 埋 在 其中 ，形 成 一 种 天 然 屏 障 ，使 酶 不 易 与 纤 维 素 分 子 接 触 ，而 木 质 素 的 非 水 溶 性 、化 学 结 构 的 复 杂 性 ，导 致 了 秸秆 的 难 降 解 性 。 所 以 ，要 彻 底 降 解 纤 维 素 ，必 须 首 先 解 决 木 质 素 的 降 解 问 题 。2.2木质素的结构特点木 质 素 是 由 苯 丙 烷 单 元通 过 醚 键 和 碳 碳 键 联 接 的 复 杂 的 无 定 形 高 聚 物，难 以被 酸 水 解 ，是 天 然 高 聚 物 中 最 难 搞 清 楚 的 一 个 领 域 其 原 因 有 两 个 方 面 ，一 是 木 质 素 的 结 构 单 元 之 间 除 醚键 联 接 外 还 有 CC 键 ；另 一 方 面 是 不 可 能 把 整 个 木 质 素 分 子 以 其 完 整 状 态 分 离 出 来。 典 型 木 质 素 是 由 松 柏 醇（Conifery alcohol），芥 子 醇（Sinapyl alcohol）和对香豆醇（p-Coumaryl alcohol） 这3 种 不 同 的 醇 作 为 先 体 结 构 物 质 组 成 基 本 的 结 构 单 元 ，这 些 木 质 素 结 构 单 元 常 常 以 它 们 的 糖 苷 形 式 贮 存在 细 胞 中 ，一 旦 需 要 合 成 木 质 素 ，它 们 便 从 这 些 糖 苷 中 释 放 出 来 这 些 木 质 素 结 构 单 元 之 间 主 要 是 通 过 醚键 和 碳 碳 键 的 方 式 联 接 % 醚 键 包 括 酚 醚 键 、烷 醚 键 和 二 芳 醚 键。在 酚 醚 键 中 愈 创 木 基-甘油-芳基醚键（-0-4）数量最多，占酚醚键的1/2左右，其次是愈创木基-甘油-芳基醚键（-0-4）。而木质素的C-C键的连接类型主要有-5，-，-1，-2和5-5.3.木质素降解微生物的种类3.1三种重要木质素降解酶 木质素是造纸工业排放黑液COD 和色度形成的主要原因, 其结构是由甲氧基取代的对- 羟基肉桂酸聚 合而成的异质多晶三维多聚体, 分子间多为稳定的醚键、C- C 键, 是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。自1934 年Boruff 和Buswell 首次发现能降解木质素的微生物种群, 人们对木质素的生物降解进行了大量研究, 1983 年和1984 年发现了木质素过氧化物酶(LiP) 和锰过氧化物酶( MnP) , 由日本吉田首次在生漆中发现的漆酶( Laccase) , 也始终引起着人们的关注。这三种酶被公认为是木质素重要的降解酶。I.木质素过氧化物酶(LiP)I.I分布及种类LiP 是第一个从黄孢原毛平革菌( Phanerochaetechrysosporium) 发现的木质素降解酶, 在木质素降解中起关键性作用。LiP 的产生菌在自然界分布相当广泛, 许多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产生LiP, 主要产生菌见表1I.II 结构及特点 LiP 代表一系列含Fe3+ 、卟啉环( IX) 和血红素附基的同工酶, 由不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同。LiP 是一种带有糖基的胞外血红蛋白, 晶体结构已有报道, 确定血红素( heme) 埋在蛋白质内, 可连接至少一个VA。木质素大分子不能接近该酶的活性中心, 其结合位点是一段有序的糖残基, 位于接近活性中心通道表面的裂缝中。光谱学研究表明LiP 有五种氧化状态, 自然状态LiP 含有高自旋Fe3+ , 被H2O2 氧化两个电子后形成LiP I( 氧带铁卟啉环自由基含 + Fe4+ ) , LiP I 经单电子还原形成LiP II( 氧带铁卟啉环含Fe4+ ) , 再经一次单电子还原, 回到自然状态,His82在活性中心通道表面的裂缝的开口处,Trp170在酶蛋白表面, 其电子传递可能有两个不同的途径: 底物- His82- Ala83- Asn84- His47- Heme 或底物-Trp170- Leu171- Heme。 LiP 的特点是能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物, 在通过电子传递体攻击木质素时, 它能从苯 酚或非酚类的苯环上夺取一个电子, 将其氧化成自由基, 继而以链式反应产生许多不同的自由基, 导致木质素分子中主要键断裂。此过程需要H2O2 的驱动, 反应如下:LiP+ H2O2 LiP I+ H2OLiP I+ SH2 SH + LiP IILiP II+ SH2 SH + LiP2SH + 2木质素2木质素自由基+ 2SH2 其中, SH2 为专一电子传递体。H2O2 可由白腐菌胞内H2O2 产生酶系产生, 且其胞内还存在过氧化物水解酶, 保证其不会受到毒害。I.III 作用机制木质素分子间主要键型是- O- 4, - O- 4 模式复合物中有A, B 两个苯环, 均可被LiP 氧化。LiP 催化- O- 4 模型物的主要反应是C- C 断裂形成VA 和2- 甲氧基苯酚。另一个重要的分支反应是C- 氧化产物的形成, 结果表明: C- 氧化产物是酚型C- 氧合芳香化合物时, 可由漆酶催化, 酚氧化酶介导的氧化反应降解; 当C- 氧化产物是非酚型C- 氧合芳香化合物时, 由于其非各种氧化酶的底物, 氧化降解非常困难。VA 是LiP 的诱导剂, 还可以保护LiP 不受H2O2 的损害。对VA 的氧化目前认为主要是由LiP 催化, 过氧化氢离子和H2O 同时参与芳香环的开裂。开环产物可被进一步代谢CO2。整个反应中生成的甲氧基酚衍生物, 由LiP 和漆酶共同氧化, 形成醌, 在纤维二糖/ 醌还原酶系、芳香环开裂酶系的协同作用下, 生成酚, 最后形成环开裂产物, 进入Kerb 循环, 或者纤维二糖酸内脂的形式进入磷酸戊糖途径, 最终代谢为CO2。而非酚型的芳香醛酸, 由于其氧化还原电位太高, 需先被芳香醛酸还原酶还原成相应的醇, 然后才能被LiP 氧化成开环产物或醌。在木质素的模式复合物中, 已被深入研究的还有- 1 型, LiP 氧化其它键型如- 5、- O- 4 模式复合物, 产物尚未被证实。I.IV 基因结构及表达 在分子生物学领域, 研究较多的是P .chrysosporium、Trametes versicolor 、Bjerkandera adusta 等。在P. chrysosporium 中已经克隆出至少7 个相近的LiP基因家族, 定名为LiPA- LiPJ, 同源性很高。核型分析表明, 异源真核菌株约含10 个染色体, 而LiP 基因至少被分布在两个染色体上。LiP 序列排列紧密且高度保守, 氨基酸相似性53% 98%, 每个LiP 基因编码一个由343 345 个氨基酸组成的成熟蛋白质, 分子量约36360 36607Da。N 端有一个21 个氨基酸的信号肽, 且有6 或7 个氨基酸的前体肽。已测序的LiP 基因均含有8 或9 个内含子, 大小49 78bp, 5端非编码区包含一个TATA 框( - 66 -81bp) 和一个CAAT 框( - 107 - 228bp) 的调节序列。在基因表达方面, 其转录明显受到C, N 水平的影响,LiP 的同工酶种类和数目随培养条件变化而改变, 至少有五种:H1、H2、H6、H8、H10。其分子量大小、等电点、光谱特性、稳定性均有差别, N 端氨基酸序列也不相同。非限制性N 源条件下, H8 是主要的同工酶, 其cDNA 序列被命名为ML- 1,H2 的表达也稍占优势, 但H6 的表达较限制性N 源条件下大大下降。在异源表达上, 已得到许多重组LiP, 但重组LiP 的功能有所改变, 如催化能力改变, 不再受Mn2+ 抑制等。II 锰过氧化物酶(MnP)II.I 分布及种类 MnP 与LiP 一样, 都是代表一系列带有糖基的胞外过氧化物酶, 因二者都含有血红素, 又称血红素过氧化物酶。MnP 的主要产生菌见表2, 主要是一些白腐真菌, 多属担子菌亚门, 无隔担子菌亚纲, 无褶菌目的多孔菌科。II.II 结构及特点 MnP 的晶体结构中包括17% 的中性糖类和大量酸性氨基酸, 血红素上仅有一个Mn2+ 的结合位点, MnP能将其氧化, 消耗一分子的H2O2, 产生两分子的Mn3+ 。Mn3+ 从MnP 上脱离后, 如果没有合适的螯合物与其结合, 保证其稳定性, 其可以在溶液中发生反应, 生成MnO2。在木质素降解过程中, MnO2 可保护LiP 免受H2O2 的损伤。而在LiP- MnP 组合酶体系中, 高浓度的Mn2+ 或Mn3+ , 加上合适的螯合物, 会导致LiP 的抑制,MnP 的诱导。可见, Mn 对LiP 和MnP 都具有重要的作用, 且作用大小与猛离子的浓度及添加时间有关。MnP 的特点是只能氧化酚型木质素。氧化苯酚的过程中, MnP 和H2O2 的启动下, 氧化Mn2+ 为Mn3+, 然后,Mn3+ 氧化苯酚生成苯氧残基。这与LiP 氧化苯酚的方式有明显不同。II.III 作用机制 MnP 降解木质素的作用机制尚不清晰, 目前认为是一个循环催化过程见图1, AH 代表酚型底物。随着研究的逐渐深入, 它在木质素降解过程中的作用越来越受到重视。II.IV 基因结构及表达 从P . chrysosporium 的胞外液中分离出至少六种MnP 的同工酶, 均由多基因编码。通过全部RNA 的反转录PCR, 能得到MnP 的三个不同基因的mRNA:MnP1、MnP2、MnP3。静置培养条件下, MnP2 是主要的MnP 表达基因, 而搅拌培养时, MnP1 是主要的表达基因,MnP3 的表达较稳定。MnP 基因有6 或7 个内含子,N 端有21 或24 个氨基酸的信号肽, 但无前体肽。活性位点附近的序列非常保守, MnP 的5 非编码区包括1个TATAA 单元( - 81bp) 及3 个反向的CCAAT 单元。启动区包括大量热休克元件和序列, 这些元件与哺乳动物金属硫蛋白基因中的金属调节元件相同 4 5 。 在基因表达方面, MnP 的产生明显依赖Mn2+ 浓度、培养基、热休克、C 和N 源变化, 且调节是在转录水平上。菌株P . chrysosporium OGC101 MnP1 编码一个357 个氨基酸的成熟蛋白, 内含子6 个, 大小57 72bp。III 漆酶III.I 分布及种类 1883 年漆酶被首次发现, 一百多年来, 人们通过大量研究发现漆酶广泛存在于多种植物和菌类的分泌物中。在真菌中, 漆酶大多分布在担子菌( Basidimycetes ) 、多孔菌( Polyporus ) 、柄孢壳菌( Podospora ) 等中。此外,一些动物肾脏和血清中也发现了漆酶, 近来, 人们发现一些细菌也能产生漆酶 6, 如生脂固氮螺菌( Azospirillum lipof erum) 。漆酶的主要高产白腐真菌王佳玲等曾作过统计。III.II 结构与特点漆酶的分子量在64 390kD 之间, 除Podosp oraanserina 产生的一种漆酶是四聚体外, 其它漆酶一般是单一多肽, 由约500 个氨基酸组成。不同种类的漆酶含铜数并不相同。一般含有四个铜离子, 根据光谱和磁性特征可分为三类: I型Cu2+ 一个, 单电子受体, 顺磁性, 蓝色, 614nm 处有特征吸收蜂; II型Cu2+ 一个, 单电子受体, 顺磁性, 非蓝色, 无特征, 吸收光谱; III 型Cu24+ 两个, 双电子受体, 反磁性, 是偶合的离子对( Cu2+ - Cu2+ ) , 330nm 处有宽的吸收带。漆酶的三维结构尚不清晰, 但证实铜离子位于酶的活性部位, 在催化氧化过程中起决定性作用。漆酶是单电子氧化还原酶, 据统计它催化氧化的底物达250 多个, 最重要的是酚及其衍生物, 约占其底物总数的一半。此外漆酶还能催化芳胺、羧酸及其衍生物, 甾体激素和其它非酚类底物, 如抗坏血酸等。III.III 作用机制漆酶是一类以O2 为电子受体的蛋白酶, 对其作用机理, 目前研究较透彻的是其催化多酚化物如氢醌, 此过程须经过四次单电子传递。首先, 底物氢醌向漆酶转移一个电子, 生成半醌- 氧自由基中间体。而后, 两分子半醌生成一分子氢醌和一分子苯醌, 氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体, 它们可以相互结合或相互偶连, 故在菌体内, 漆酶与其它氧化木质素酶系协同降解木质素。而在体外实验中, 木质素单体在Laccase/ O2 条件下会发生聚合反应。O2 存在条件下,还原态漆酶被氧化, O2 被还原成水, 此过程是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的:Cu2+ Cu2+ Cu24+2e底物Cu+ Cu+ Cu24+分子内电子转移Cu2+ Cu2+ Cu22+2e底物Cu+ Cu+ Cu2+2H+ O2H2O 快Cu2+ Cu2+ ( Cu2O) 3+2H+H2O 慢Cu2+ Cu2+ Cu24+III.IV 基因结构及表达 漆酶是由一个结构相近的基因家族编码, 许多真菌的漆酶基因已被克隆和测序, 如Agaricus bisporus 、Neurospora crassa。从Coprinus cinerens 中克隆出3 个漆酶基因Lcc1、Lcc2 和Lcc3。其中Lcc1 含7 个内含子, 大小为54 70bp, 成熟蛋白约521 个氨基酸, 有三个潜在的N- 连接糖基化位点, C 端有23 个氨基酸的延伸序列, 富含Arg 和Lys, 其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和C 端延伸区。Lcc2 和Lcc3 均有13 个内含子,表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80% 。Lcc3 和Lcc1的氨基酸同源性58% , Lcc2 和Lcc1 的氨基酸同源性59%, 而Lcc3 与Aspergillus nidulan 漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此, 异源真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低, 但在铜结合区具有较高保守性。 在异源表达上, 曲霉是一个很好选择, A. oryazeTATAamylase 和Pichia past i 系统已成功表达若干不同来源的漆酶, Lcc1 在米曲霉中表达成功, 90% 以上的转化体表现出漆酶活性, 目前, 已有许多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表达。3.2 三种木质素降解酶协同作用 对上述三种酶的研究主要集中在液体培养方式上, 结果显示采用静置培养, 深层培养利于酶的产生。已证明, 木质素降解酶活性受C 源、N 源、微量元素、诱导物、培养温度和pH 值等因素影响。而P.cinnabarinus 的漆酶产量却不受一些小分子芳香化合物的诱导。确定单一一种酶在木质素降解中的功能非常困难, 因为每一种白腐菌所产生的都不是一种木质素降解酶, 如Laccase 和MnP 单独存在都不能很好的降解木质素, 而两种酶同时存在时, 木质素却能得到很好降解, 表明两种酶具有协同作用。有趣的是当体系中一些条件变化时, 体系中的两种或几种木质素降解酶会发生相互抑制现象, 如液体培养条件下, Mn2+ 浓度增加会导致LiP 活力大大降低, 而MnP 和Laccase 的活力却相应增加, 这启示我们这种协同作用可能存在正负两种机制。不同白腐菌木质素降解酶系的组成大不相同, 可分为四类: LiP - MnP, 如P . chrysosporium; LiP_MnP_Laccase, 如Trametes gibbosa; MnP_Laccase, 如Lentinula edodes ;LiP_Laccase, 如Pleurotus ostreatus 。最新研究表明, 不同降解酶系成分之间的比例将直接影响木质素降解效果。各种酶系具体如何分工协作降解木质素, 尚不清楚, 将是今后研究的一个热点。4 应用全景 4.1 木质素降解酶的全景 在 自 然 界 中 ，能 降 解 木 质 素 并 产 生 相 应 酶 类 的 生 物只 占 少 数。木 质 素 的 完 全 降 解 是 真 菌 、细 菌 及 相 应 微 生物 群 落 共 同 作 用 的 结 果 ，其 中 真 菌 起 着 主 要 作 用。 降 解木 质 素 的 真 菌 根 据 腐 朽 类 型 分 为 ：白 腐 菌 使 木 材 呈白 色 腐 朽 的 真 菌 ；褐 腐 菌 使 木 材 呈 褐 色 腐 朽 的 真 菌和 软 腐 菌 。 前 两 者 属 担 子 菌 纲 ，软 腐 菌 属 半 知 菌 类。 白 腐菌降 解 木 质 素 的 能 力 尤 于 其 降 解 纤 维 素 的 能 力 ，这 类菌 首 先 使 木 材 中 的 木 质 素 发 生 降 解 而 不 产 生 色 素 。 而 后两 者 降 解 木 质 素 的 能 力 弱 于 其 降 解 纤 维 素 的 能 力 ，它 们首 先 开 始 纤 维 素 的 降 解 并 分 泌 黄 褐 色 的 色 素 使 木 材 黄褐 变 ，而 后 才 部 分 缓 慢 地 降 解 木 质 素。 白 腐 菌 能 够 分 泌胞 外 氧 化 酶 降 解 木 质 素 ，因 此 被 认 为 是 最 主 要 的 木 质 素降 解 微 生 物。目 前 ，研 究 最 多 的 白 腐 菌 有 ：黄 孢 厚 毛 平 革 菌(Phanerochete chrysosporium)、 彩 绒 草 盖 菌（Coridus versicolor）、 变 色 栓 菌（Thametes versicolor）、 射 脉 菌（Phlebia radiata）、 凤 尾 菇（Pleurotus pulmononanus）、 朱 红 密 孔 菌（Pycnoporus cinnabarinus）等.这 些 菌 多 属 于 担 子 菌亚 门 ，无 隔 担 子 菌 亚 纲 、无 褶 菌 目 的 多 孔 菌 科 . 王 佳 铃 等 曾 评 述 过19811995 年 间 研 究 报 道 过 的 主 要 高 产漆 酶 白 腐 真 菌（ 表 1）。褐 腐 菌 的 软 腐 菌 中 的 有 些 种 类也 可 以 分 泌 一 些 降 解 木 质 素 的 酶类 ，但 它 们 分 解 木 质 素 的 能 力 不 是很 强 ，因 此 ，研 究 报 道 较 少.降 解 木 质 素 的 原 核 生 物 以 放 线菌为 主 ，如 链 霉 菌 属（Streptomyces）、节 杆 菌 属（Arthrobaeter）、 小 单 孢 菌属 （Micromonoyticum） 和 诺 卡 氏 菌（Nocardia）等。 细 菌 中 有 厌 氧 梭 菌（Clostridum xylanoyticum）、 假 单 孢 菌（Pseudomonas）、 不 动 杆 菌（Acinetobacter）和 芽 孢 杆 菌（Bacillus）等 原 核生 物 对 于 在 土 壤 中 木 质 素 的 转 化 和降解 具 有 重 要 作 用 ，但 土 壤 中 木 质素 的 降 解 据 报 导 是 土 壤 微 生 物 区 系多 种 类 型 微 生 物 协 同 进 行 的 结 果 ，而 且 进 程 缓 慢 ，单 一 微 生 物 纯 培 养 的 商 业 用 途 前 景 不 很 清 晰 ，且 这 类 原核 生 物 的 多 酚 氧 化 酶 是 胞 内 酶 ，这 也 决 定 了 其 在 木 质 素 降 解 菌 的 研 究 中 处 于 一 个 相 对 从 属 的 地 位. 此 外 ，很 多 植 物 病 原 微 生 物 如Rhizoctonia solani R.praticola等 也 具 有 分 解 木 质 素 的 能 力 ，但 这 类 微 生物 在 处 理 秸 秆 上 的 应 用 前 景 不 大.在 木 质 素 降 解 微 生 物 中 ，研 究 得 最 多 最 彻 底 和 最 具 应 用 前 景 的 是 黄 孢 原 毛 平 革 菌。 这 种 微 生 物 的 特 点是 培 养 温 度 高（37 左 右 ）， 无 性 繁 殖 迅 速 ，菌 丝 生 长 快 且 分 泌 木 质 素 降 解 酶 能 力 强 ，它 已 经 成 为 研 究 白 腐真 菌 的 一 种 模 式 微 生 物 它 的 培 养 条 件 、代 谢 调 控 、分 子 生 物 学 和 遗 传 学 及 其 在 生 产 实 践 上 的 应 用 等 均 已被 研 究 的 相 当 仔 细。4.2 木质素降解酶的特性目 前 ，关 于 木 质 素 降 解 酶 的 研 究 工 作 主 要 集 中 在 白 腐 菌 所 产 生 的 酶 系。 研 究 得 较 多 ，并 认 为 最 为 重 要的 木 质 素 降 解 酶 有3 种 ，即 木 质 素 过 氧 化 物 酶（Lignin peroxidases/Lip） 、 锰 依 赖 过 氧 化 物 酶（Manganese perxidases/Mnp） 和 漆 酶（Laccase）.LiP,MnP和Laccase只 是 分 别 代 表 一 系 列 的 同 功 酶 。 但 各 种 微 生 物 所 产 生 的 酶的 种 类 和 一 些 理 化 特 性 是 有 所 不 同 的。 其 中 LiP 是 第 一 个 从 黄 孢 原 毛 平 革 菌 发 现 的 木 质 素 降 解 酶 ，以 后 又分 别 从 射 脉 菌 ，彩 绒 革 盖 菌 ，变 色 栓 菌 中 发 现.Laccase 没 有 在 黄 孢 原 毛 平 革 菌 中 发 现 ，而 在Phlebia,Trametes,Coriolus 等 菌 中 发 现。木 质 素 的 降 解 酶 系 是 非 常 复 杂 的 一 个 体 系 ，很 多 问 题 至 今 还 不 十 分 清 楚. 除 了 上 述3 种 重 要 的 酶 外 ，其 它 的 一 些 酶 如 芳 醇 氧 化 酶（AAO）、 酚 氧 化 酶 、葡 萄 糖 氧 化 酶 、过 氧 化 氢 酶 及 一 些 还 原 酶 、甲 基 化 酶 和 蛋 白酶 等 都 参 与 或 对 木 质 素 的 降 解 产 生 一 定 的 影 响 .LiP 和 Mnp 都 是 带 有 糖 基 的 胞 外 血 红 素 蛋 白.又 称 血 红 素 过 氧 化 物 酶（Heme Peroxidase）， 它 们 在 反 应中 从 苯 酚 或 非 酚 类 的 苯 环 上 夺 取 一 个 电 子 而 使 后 者 形 成 一 个 阳 离 子 基 团 ，从 而 导 致 木 质 素 分 子 中 主 要 键的 断 裂. LiP 主 要 是 氧 化 苯 酚 使 之 成 为 苯 氧 残基. Mnp 主 要 是 从 Mn2+ 和 H2O2 的 氧 化 中 得 到Mn3+，然 后Mn3+氧 化 苯 酚 使 之 成 为 苯 氧 残 基 而 每 种 酶 在 木 质 素 降 解 中 的 具 体 作 用 还 不 甚 清 楚.漆 酶（Laccase） 是 含 铜 的 多 酚 氧 化 酶 ，主 要 来 源 于 生 漆 和 真 菌。 由 于Laccase 的 含 糖 量 高 ，难 得 到X-衍 射分 析 用 的 漆 酶 单 晶 ，它 的 三 维 空 间 结 构 尚 不 清 楚 . 但 已 经 证 实 ，漆 酶 中 的 铜 离 子 在 催 化 氧化 反 应 中 起 决 定作 用.根 据 磁 学 和 光 谱 性 质 可 将 漆 酶 中 的 4个 铜 离子 分 为 3类 ：I 型 Cu2+和 II型Cu2+各 1 个 ，是 单 电 子 受体 ，呈 顺 磁 性 ，可 以 用 核 磁 共 振 控 测 ；III型Cu2+ 2 个 ，是 双 电 子 受 体 ，反 磁 性 ，用 核 磁 共 振 不 能 检 测. ! I型Cu2+ 呈 蓝 色 ，在614nm特 征 吸 收 峰 ；II型Cu2+为 非 蓝 色 ，没 用 特 征 吸 收 峰 ；III型Cu24+ 的 离 子对（Cu2+Cu2+ ），在30 处 有 宽 的 吸 收 峰.在 木 质 素 降 解 过 程 的 机 制 和 作 用 至 今 人 们 还 不 完 全 清 楚。作 为 一 种 多 酚 氧 化 酶 ，它 可 催 化 氧 化 酚类 或 芳 胺 类 等 多 种 底 物 的 氧 化 作 用 。 氧 化 酚 或 芳 胺 先 失 去 一 个 电 子 生 成 自 由 基 ，后 者 发 生 一 系 列 非 酶 反应 ，氧 化 成 醌 ，在 有O2存 在 时 ，还 原 态 漆 酶 被 氧 化 ，O2 还 原 成 水 底 物 自 由 基 不 稳 定 ，可 进 一 步 发 生 键 的 断裂 或 生 成 ，导 致 裂 解 或 聚 合 反 应。因 此 ，底 物 分 子 可 进 一 步合 生 成 复 杂 的 产 物 ，也 可 催 化 芳 香 环 支 链 C -C断裂。 GALIANO 等发 现 ，当Laccase和MnP 分 别 单 独 存 在 时 ，都 不 能 有 效 地 降 解 木 质 素 ，而 2 种 酶 同 时 存 在时 则 木 质 素 得 到 有 效 的 降 解 ，这 表 明 2种 酶 在 催 化 木 质 素 生 物 降 解 反 应 中 具 有 协 同 作 用 .此 外 还 发 现 在 反应 中 加 入 其 它 的 酶 ，如 葡 萄 糖 氧 化 酶 时 ，可 显 著 提 高 木 质 素 的 降 解 程 度 .他 们 认 为 ，这 是 由 于Laccase 既 有解 聚 ，又 有 聚 合 木 质 素 的 能 力 ，加 入 葡 萄 糖 氧 化 酶 可原Laccase 氧 化 多 酚 产 生 的 醌 等 阻 止 木 质 素的 聚 合 作 用 ，从 而 提 高Laccase 的 降 解 能 力.确 定 每 一 种 酶 在 木 质 素 降 解 过 程 中 的 作 用 和 功 能 是 困 难的 ，因 为 至 少 目 前 木 质 素 被 微 生 物 所 产 生 的单 一 胞 外 酶 彻 底 、完 全 地 催 化 解 聚 和 降 解 的 情 况 还 没 被 发 现 .每 一 种 白 腐 真 菌 所 产 生 的 都 不 只 是 一 种 能 降解 木 质 素 的 酶 ，在 缺 陷 任 一 种 酶 的 体 系 中 木 质 素 仍 能 够 较 好 的 降 解 ，而 这 些 酶 之 间 又 相 互 作 用 和 影响 ，使其 存 在 于 一 个 协 同 作 用 体 系 中.虽 然 现 在 已 能 用 14C标 识 的 合 成 木 质 素 来 研 究 木 质 素 降 解 酶 在 木 质 素 降 解中 的 作 用 机 理 ，但 由 于 木 质 素 的 结 构 复 杂 ，木 质 素 的 彻 底 降 解 需 依 赖 微 生 物 区 系 中 多 种 微 生 物 在 较 长 时 间内 相 互 交 替 的 生 长 繁 殖 才 能 完 成.4.3 木质素的降解微生物的酶活性调控机理在 白 腐 菌 产 酶 的 培 养 方 式 上 ，研 究 最 多 的 是 液 体 培 养 .国 内 外 曾 利 用 多 种 不 同 有 机 、无 机 或 复 合 碳 源和 氮 源 来 研 究 它 们 对 微 生 物 的 木 质 素 降 解 能 力 和 产 酶 能 力 的 影 响 .还 研 究 了 碳 源 或 氮 源 限 制 对 它 们 的 影响 .结 果 表 明 ，碳 源 和 氮 源 是 微 生 物 降 解 木 质 素 和 产 酶 的 一 个 极 为 重 要 的 影 响 因 素.不 同 的 单 糖 、双 糖 作 碳 源 的 矿 质 培 养 基 培 养 豹 斑 革 菌 时 ，用 麦 芽 糖 生 物 的 生 长 量 最 高. 标 准 培养 条 件 下 ，以 葡 萄 糖 作 对 照 ，甘 露 糖 和 麦 芽 糖 使MnP 分 别 增2倍 和3.8 倍。酵母 汁 、牛 肉 膏 等 复 合 氮 有利 于LiP 活 性 的 提 高 ，而 甘 氨 酸 、柠 檬 酸 铵 、乙 醇 胺 等 则 抑 制LiP的 生 成 和 活 性. 毛 平 革 菌 等 白 腐 菌 的 木 质 素 降 解 和 木 质 素 降 解 酶 的 产 生 是 发 生 在 氮 源 或 其 它 营 养 被 消 耗 的 次级 代 谢 过 程 中 .而 细 菌 则 与 之 相 反 ，高 浓 度 的 有 机 或 无 机 氮 源 都 不 能 抑 制 木 质 素 降 解 ，所 产 生 的 过 氧 化 物酶 也 具 有 与 生 长 相 联 和 不 受 高 水 平 氮 抑 制 的 特 点 .我 国 学 者 李 越 中 等 曾 对 黄 孢 原 平 革 菌 合 成 木 质 素 过 氧化 物 酶 的 营 养 调 控 进 行 过 较 为 详 细 的 研 究 报 道（ 表 2、表 3）。微 量 元 素 对 于 白 腐 菌 相 关 酶 类 的 产 生是 有 较 大 影 响 的 。 漆 酶 是 一 种 含 铜 的 多 酚 氧 酶 ，因 此 ， Cu 对 于 漆 酶 的 产 生 和 酶 活 性 是 相 当重 要 的Mn对LiP和MnP都 具 有 重 要 的 作 用 ，对 漆 酶 的 影 响 也 是 显 著 的. BINNARME等 认 为 ， Mn2+对LiP 有 抑 制 作 用 ，而 对MnP 则 有 诱 导 作用 ，其 作 用 的 大 小 与Mn2+ 的 浓 度 及 添 加 时 间 有关. C.subuermispora在Mn2+ 浓 度为1110-6molL-1时 ，木 质 素 矿 化 速 率 最 大 ，而MnP 和Laccase 的 活 性 在4.010-6 molL-1 时 最 高 . 不 添 加Mn2+可 使Agaricus campestris 的Laccase 活 性 显著 降 低 ，但Mn2+ 对 其 影 响 是 以Cu2+ 的 存 在 为前 提 ，如 果 没 有Cu2+存 在 ，那 么Laccase 的 活 性则 与Mn2+ 浓 度 无 关 且 酶 活 性 始 终 很 低.有 报道 ，高 浓 度 的Mn2+ 会 提 高Phlebia breispora 的Laccase 活 性 ，但 对Dichomitus 来 说 ，Laccas 活 性都 不 受Mn2+的 影 响. 结 构 和 木 质 素 有 关 的 低 分 子 芳 香 化 合 物 或木 质 素 降 解 的 碎 片 化 合 物 ，可 诱 导Laccase 产 生并提 高 其 酶 产 量 ，这 类 化 合 物 如 香 草 酸 、藜 芦醇 、愈 创 木 酚 、吐 温 、甲 苯 胺 等.在 豹 斑 革 耳 菌 上还 发 现 了 专 一 的MnP 诱 导 物3-甲 基 苄 醇. 培养 温 度 、通 气 状 况 ，P H 值 乃 至 环 境 湿 度等 ，也 是 影 响 木 质 素 降 解 酶 产 生 的 因 素 .如 黄 孢原 毛 平 革 菌 的 最 适 生 长 温 度 为 3 7 ，最 适 产 酶温 度 为30豹 斑 革 耳 菌 增 加 通 气 可 使 木 质 素矿 化 率 有 所 提 高 ，而 对 于 Phlebia radiata来 说 ，通 氧 则 抑 制 其 酶 活 性 . 培 养 温 度 和 P H值 对Laccas 的 影 响 因 具 体 菌 种 而 异 ，不 同 的 菌 种 有不 同 的 适 宜 培 养 温 度 和 P H值. 4.4 木质素的生物降解的应用 木 质 素 的 生 物 降 解 目 前 成 功 地 用 于 生 产 实 践 的 实 际 应 用 尚 不 多 见 ，但 在 有 些 方 面 的 研 究 已 经 显 现 出诱 人 的 前 景. 1) 造 纸 工 业 分 解 木 质 素 的 酶 类 在 造 纸 工 业 上 的 应 用 有 两 个方 面 ，一 是 用 改 造 旧 的 造 纸 工 艺 ，用 于 生物 制 浆 、生 物 漂 白 和 生 物 脱 色 - 黄 孢 原 毛 平 革 菌 和P.brevispora等 在 国 外 已 经 得 到 成 功 利 用 - 如 用P.brevispora 进 行 生 物 制 浆 预 处 理 可 降 低47% 的 能 耗 并 增 加 了 纸 浆 的 张 力 ，但 它 们 的 木 质 素 降 解 率 和 产 酶 量 都 还是 极 为 有 限 的 ，处 理 时 间 过 长 ，距 大 规 模 推 广 应 用 尚 有 一 定 的 距 离 .二 是 木 质 素 分 解 菌 或 酶 类 用 于 造 纸 废水 的 处 理 ，这 方 面 的 国 内 外 研 究 报 告 已 有 很 多 且 已 取 得 了 一 定 的 实 效. 2) 饲 料 工 业 木 质 素 分 解 酶 或 分