谷朊粉水解物螯合锌的制备工艺研究.doc

食品药品学院 本科毕业论文目 录摘要1关键词1前言11材料与方法11.1试剂与仪器11.1.1原料11.1.2试剂11.1.3仪器11.2方法31.2.1谷朊粉水解物的制备工艺31.2.2螯合物的制备工艺 3 1.2.3指标的测定方法31.2.4螯合物制备条件的优化41.2.5螯合物的鉴定方法42.结果与分析42.1单因素试验结果分析42.1.1谷朊粉水解物制备方法对螯合反应的影响42.1.2 pH值对螯合反应的影响52.1.3谷朊粉水解物与锌离子质量比对螯合反应的影响62.2正交试验结果分析72.3螯合物的鉴定83.讨论83.1影响螯合反应的因素83.2指标的分析83.3试验可以改进的方面83.4谷朊粉水解物螯合锌的研究前景84.结论9致谢9参考文献9英文翻译10谷朊粉水解物螯合锌的制备工艺研究食品质量与安全： 指导老师： 摘要：优化谷朊粉水解物与锌的螯合工艺。以谷朊粉为原料，氯化锌作为锌源，通过单因素试验研究谷朊粉水解物与锌离子质量比、谷朊粉水解物的制备方法、pH值对螯合反应的影响，并采用正交试验对螯合工艺进行优化，化学方法对螯合物进行初步鉴定。最佳的螯合工艺条件为：谷朊粉水解物的制备方法为碱性蛋白酶法，pH值为8.0，谷朊粉水解物与锌离子质量比为4:1；该条件下螯合物得率为50.3%；螯合率为85.3%。关键词：谷朊粉；锌；螯合物前言谷朊粉又称活性面筋，蛋白质含量高达75%以上，主要是麦谷蛋白和麦醇溶蛋白。其氨基酸较均衡，通过与其他食物性蛋白按比例混合，还可以弥补赖氨酸含量较缺乏的缺点，在食用中充分保证营养。另外，谷朊粉中脂肪、糖较低，钙、磷、铁含量均较高，尤其是钙含量远远大于鸡蛋、牛肉等食品，完全符合人们对健康膳食结构的要求1。因此，谷朊粉很早便被应用于食品中，例如传统食品中的烤麸、古老肉、素鸡、素鸭、素肠、油面筋等。在现代食品中，谷朊粉通常作为食品添加剂、品质改良剂，甚至可以作为某些食品的替代品。因为谷朊粉其具有特殊的黏弹性和拉伸性，作为一种纯天然的食品添加剂，所以用来改善面粉的品质，有着无可比拟的优势。对面条专用粉，添加谷朊粉能提高面条的抗挤压力、抗弯曲力和抗拉应力。尤其是对通心面效果更为显著，有效地减少了蒸煮损失和防止变细，提高了筋力和其罐装产品中的耐热性面团的弹性、持气性2，面团发酵时间缩短，延缓面包的老化，面包的烘焙特性变好，使面包颜色加深、香味浓，效果更好3-4。目前谷朊粉在固体型食品中得到广泛应用，但在液体类食品(如饮料、乳制品)中研究受到很多限制，主要是谷朊粉含有较多的疏水性氨基酸，分子内疏水作用区域较大，溶解度小，往往不能满足食品加工的需要。因此，改善谷朊粉功能性质对拓宽其应用范围具有重要意义 5。近年来利用鱼类蛋白螯合金属离子以提高其在人体的利用率的研究较多，而谷朊粉生产量大、价格低廉，可作为一种较好的螯合基资源加以利用，以提高产品的附加值。锌是人体必需的微量元素之一，其含量仅次于铁。它参与人体内300余种酶和功能蛋白的组成，对代谢活动起重要的调节作用。它与人体的生长发育、智力发育、免疫功能、脂质代谢等有着密切的关系。虽然自然界中锌源十分丰富，但由于锌在人体内的吸收代谢受种种因素的限制，人类膳食中锌的相对缺乏并不罕见，婴幼儿、老人、妊娠期妇女的锌缺乏已被广泛研究6。据北京、杭州、郑州等20多个城市调查发现，约有4060%的儿童缺锌7。我国有300多万先天愚型的儿童，经遗传、免疫和临床研究，均显示和缺锌有关。婴幼儿、儿童、青少年，生长发育速度较快，对锌营养的需求量很高，但往往饮食搭配不合理，造成锌摄入量不足。锌主要存在于动物性食品中，我国家庭中多以植物性食物为主，而且植物性食品中的草酸、植酸等严重干扰锌的吸收。为什么北方人个头比南方人高？有研究表明，主食是造成这种情况的重要原因。习惯吃馒头的北方人长得比较高，而习惯吃米饭的南方人则相对矮一些，这是因为在米面中存在植酸，它能够与锌元素结合，形成化合物，使得人体无法正常吸收，导致缺锌。不过，存在于米面中的植酸也有一个特点，如果把它发酵，植酸就会减少，不再对锌的吸收产生影响。另据调查，吃面包的西方人，缺锌状况就相对较少8。除了食物固有因素带来的吸收问题，朱璘9等人研究了有机锌对小鼠免疫功能的影响，结果表明：有机螯合锌能增强免疫低下小鼠的非特异免疫功能和特异性细胞免疫及体液免疫功能，与无机锌相比有机锌吸收利用率更高。早在20世纪6070年代人们就已经发现氨基酸和小肽具有促进锌吸收的作用，且氨基酸和肽的金属复合体如Fn、Zn和Mn的生物学利用率比无机盐高，且无毒副作用10-11。因此在日常饮食中合理添加有机锌是一条预防缺锌切实可行而有效的途径，但由于现在的有机锌价格都比较昂贵，而不利于强化普及使用。本项目将谷朊粉的精深加工利用与营养强化剂研制（螯合锌）相结合，可有效降低有机螯合锌的成本、提高谷朊粉的附加产值。对于食品强化锌制剂的开发具有积极意义，可有效提高强化食品中锌的吸收、利用率，对锌需要量较大的儿童、孕妇、乳母等特殊人群具有重要意义。1材料与方法1.1试剂与仪器1.1.1原料 谷朊粉(江苏睢宁科泰小麦蛋白科技有限公司)。1.1.2试剂 胃蛋白酶（BR，中国医药集团上海试剂公司）；胰蛋白酶（BR，中国医药集团上海试剂公司）；碱性蛋白酶（BR，中国医药集团上海试剂公司）；氯化锌(AR国药集团化学试剂有限公司)；硫化钠(AR,上海统亚化工科技发展有限公司)；乙二氨四乙酸二钠（BR，国药集团化学试剂有限公司）。1.1.3仪器79-1磁力加热搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂SHB-循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸易有限公司KDL-20低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司PHS-3D精密PH计 上海精科公司101C-3B型电热鼓风干燥箱 黄石力恒丰医疗器械有限公司1.2方法1.2.1谷朊粉水解物的制备工艺分别称取50g谷朊粉于1000mL大烧杯中用蒸馏水定容在90水浴20min冷却调节pH值调节温度加酶水解（期间用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCL维持pH稳定）灭酶活（沸水浴5min）冷却离心分离(3500r/min离心10min)取上清液浓缩干燥谷朊粉水解物12。各制备方法具体见表1。表1谷朊粉水解物的制备Table1 Preparation of gluten flour制备方法pH值加酶量（E/S）温度（）反应时间（h）胰蛋白酶8.50.01475胃蛋白酶2.00.01373碱性蛋白酶8.50.016031.2.2螯合物的制备工艺称取一定量的谷朊粉水解物于500ml大烧杯中用蒸馏水溶解加入一定量的氯化锌溶液调节pH值在水浴501h离心分离（4500r/min离心10min）获得沉淀无水乙醇洗涤抽滤23次少量乙醚洗涤抽滤100左右烘干螯合物13。1.2.3指标的测定方法螯合物得率的测定螯合物得率按下式计算：W0反应物总重量（g）；W螯合物总重量（g）。螯合率的测定准确移取谷朊粉水解物螯合液5mL于50mL容量瓶中，定容，摇匀，用EDTA络合滴定法测定锌离子的总量；另移取谷朊粉水解物螯合液5mL于烧瓶中浓缩至近干，加入15mL无水乙醇离心分离，将所得沉淀用水溶解定容在50mL容量瓶中，定容，摇匀。用EDTA络合滴定法测定螯合态锌离子的含量。EDTA络合滴定：准确移取20mL试液于锥形瓶中，加两滴二甲酚橙指示剂，滴加质量分数为20的六亚甲基四胺至溶液呈现稳定的紫红色，再加4mL六亚甲基四胺。用EDTA滴定，当溶液由紫红色转变为黄色时为滴定终点。V1滴定螯合态锌离子所消耗的EDTA溶液体积（mL）；V0滴定全部锌离子所消耗的EDTA溶液体积（mL）。1.2.4螯合物制备条件的优化单因素试验在其他条件都相同的情况下，以螯合物得率和螯合率为指标，分别考察谷朊粉水解物的制备方法（胰蛋白酶法、胃蛋白酶法、碱性蛋白酶法)、pH值（6、7、8、9）、谷朊粉水解物与锌离子质量比（3:1、4:1、5:1、6:1）3个因素对螯合物制备的影响。正交试验在单因素试验的基础上，选择水平进而设计L9(33)正交试验，以螯合物得率和螯合率为指标，优选最佳螯合工艺。1.2.5螯合物的鉴定方法采用Na2S化学鉴定法对制备的螯合物进行定性分析。取一定量纯化后的螯合物样品，加入50mL蒸馏水溶解，再加入茚三酮试剂58滴，在电炉上加热沸腾23min，溶液颜色不变。另取一定量纯化后的氨基酸螯合物样品，加入25mL蒸馏水溶解，再加入过量的硫化钠，用玻璃棒搅匀，静置一段时间后得到黄色溶液，在溶液中再加入茚三酮试剂58滴，在电炉上加热沸腾23min，溶液由黄色变为紫红色则里面含有游离氨基酸。即样品中含有氨基酸螯合物。2.结果与分析2.1单因素试验2.1.1谷朊粉水解物制备方法对螯合反应的影响在谷朊粉水解物与锌离子质量比为4:1，pH值为8.0条件下，制备方法对螯合反应的影响见图1。注：1.胰蛋白酶法；2.碱性蛋白酶法；3.胃蛋白酶法。图1谷朊粉水解物制备方法对螯合反应的影响Fig.1 Effects of preparation methods gluten flour hydrolysate on chelation reaction由图1可知，谷朊粉水解物的制备方法对螯合反应影响较明显，不同的谷朊粉水解物由于制备时采用的蛋白酶不同，因此谷朊粉的水解度不同，得到的谷朊粉水解物差异较大，这直接影响到螯合物得率和螯合率。当谷朊粉水解物与锌离子质量比为4:1，pH值为8.0条件下，碱性蛋白酶法有较高的螯合物得率和螯合率。2.1.2 pH值对螯合反应的影响用碱性蛋白酶法制备的谷朊粉水解物与Zn2+螯合，谷朊粉水解物与锌离子质量比为4：1时，pH值对螯合反应的影响见图2。图2 pH值对螯合反应的影响Fig2 Effects of pH value on the chelation reaction由图2可见，pH值是螯合物制备的重要影响因素。在pH值较低的酸性条件下，H+将与金属离子Zn2+竞争供电子基团，不利于螯合物的生成；在pH较高的碱性条件下，OH-与供电子基团争夺金属离子Zn2+而形成氢氧化锌沉淀。当用碱性蛋白酶法制备的谷朊粉水解物与Zn2+螯合，谷朊粉水解物与锌离子质量比为4：1时，随着pH值的升高，螯合物得率和螯合率逐渐增大，当pH值为8.0时螯合物得率和螯合率达到最大，再增加pH值，螯合物得率和螯合率开始下降。2.1.3谷朊粉水解物与锌离子质量比对螯合反应的影响用碱性蛋白酶法制备的谷朊粉水解物用于螯合，螯合反应的pH值为8.0时，谷朊粉水解物与锌离子质量比对螯合反应的影响见图3。图3 谷朊粉水解物与锌离子质量比对螯合反应的影响Fig.3 Effects of mass ratio of gluten flour hydrolysate to zinc ion on the chelation reaction有图3可知，谷朊粉水解物与锌离子质量比对螯合反应的影响很大，若比值过大，谷朊粉水解物的利用率下降，造成原料浪费；比值过小，螯合反应不明显，生成的螫合物不稳定。当用碱性蛋白酶法制备的谷朊粉水解物用于螯合，螯合反应的pH值为8.0，谷朊粉水解物与锌离子质量比为4:1时，螯合物得率最大，再增大谷朊粉水解物与锌离子质量比，螯合物得率明显下降；螯合率在谷朊粉水解物与锌离子质量比为4:1时最大，再增大谷朊粉水解物与锌离子质量比，螯合率基本不变。2.2正交试验结果分析 通过单因素试验得到正交试验因素水平见表2。试验结果见表3.水平谷朊粉水解物的制备方法（A） pH值（B）谷朊粉水解物与锌离子质量比（C）1胰蛋白酶法73:12胃蛋白酶法84:13碱性蛋白酶法95:1表2 正交试验设计因素水平Table2 Levels and factors of the orthogonal experiment表3 正交试验结果Table 3 results of the orthogonal test水平因素螯合物得率（%）螯合率（%）ABC111123.634.5212241.574.4313322.138.8421222.434.2522327.250.3623117.537.8731333.965.8832130.141.3933241.374.5螯合物得率结果如下k129.126.623.7k222.432.935.1k335.127.027.7极差R12.7333333336.311.333333333螯合率结果如下k149.2 44.8 37.9 k240.8 55.3 61.0 k360.5 50.4 51.6 极差R19.16666666710.523.766666667由表3可知，影响螯合物得率的因素的主次顺序为ACB，即谷朊粉水解物的制备方法谷朊粉水解物与锌离子质量比pH值，其最佳的螯合工艺条件为A3C2B2，影响螯合率的因素主次顺序为CAB，即谷朊粉水解物与锌离子质量比谷朊粉水解物的制备方法pH值，其最佳的螯合工艺条件为C2A3B2，总的来看当谷朊粉水解物的制备方法为碱性蛋白酶法，pH值为8.0，谷朊粉水解物与锌离子质量比为4：1，此条件下螫合物得率最大为50.3%，螯合率最大为85.3%。2.3螯合物的鉴定加入过量的硫化钠前样品水溶液中，用茚三酮试剂检测，溶液颜色未发生改变；加入过量的硫化钠后样品水溶液中得到的黄色滤液，用茚三酮试剂检测，溶液变为紫红色，即样品溶液中没有游离的氨基酸或小肽，在生成金属无机盐沉淀后溶液中有游离的氨基酸或小肽。这说明待测物质是谷朊粉水解物和锌离子形成的一种特殊物质，该物质即是谷朊粉水解物与锌的螯合物。3讨论3.1影响螯合反应的因素 影响螯合反应的因素较多，除了该试验的3个因素外，锌盐的种类、螯合反应时间、螯合反应温度及肽或氨基酸的浓度等也对螯合反应有一定影响，考虑到试验条件的限制，在查阅相关文献的基础上最终选取了谷朊粉水解物的制备方法、谷朊粉水解物与锌离子质量比、pH值3个最主要的影响因素优化螯合工艺条件。通过研究表明谷朊粉水解物的制备方法是影响螯合物得率的最主要因素，谷朊粉水解物与锌离子质量比是影响螯合率的最主要因素。3.2指标的分析螯合物得率和螯合率是2个不同的概念，两者并无直接的关系，总的来说螯合物得率大时，也会有较高的螯合率，但螯合率大时螯合物得率不一定大。螯合物形成的机制尚不很清楚，推测是谷朊粉水解物中氨基酸或肽上的一些基团与锌离子发生螯合反应形成配位键，从而生成了螯合物。3.3试验可以改进的方面谷朊粉水解物的制备方法可以再多选择几种，比如用中性蛋白酶法、木瓜蛋白酶法等。pH取值范围更精确些，比如6.5、7、7.5、8、8.5。3.4谷朊粉水解物螯合锌的研究前景谷朊粉水解物是各种肽和氨基酸的混合物，它们都能与锌离子发生螯合反应，形成氨基酸锌或小肽的锌螯合物。该物质性质稳定，在肠道中不受植酸等因素的影响，并能以氨基酸和小肽的吸收模式，因此能大大提高锌的利用率，且在补锌的同时又能补充人体必需的氨基酸，一种较理想的食品营养强化剂，值得进一步研究开发。4结论通过单因素试验选择了因素水平，谷朊粉的制备方法（胰蛋白酶法、胃蛋白酶法、碱性蛋白酶法)、pH值（6、7、8）、谷朊粉水解物与锌离子质量比（3:1、4:1、5:1、）来做正交试验。再通过正交试验得到结论，最佳螯合工艺条件为：谷朊粉水解物的制备方法为碱性蛋白酶法，pH值8.0，谷朊粉水解物与锌离子质量比为4:1,此条件下螯合物得率为 50.3%，螯合率为84.5%，由于时间有限，对于螯合物的理化性质、结构及其生物活性测定等还有待于今一步研究。致谢：此论文是在我的导师高红梅老师和丁志刚老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。高老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。丁老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向高老师和丁老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们!最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢！参考文献1 刘延奇,郭妤微.谷朊粉改性技术研究进展J.粮食与食品工业,2007,(4):1-23.2 彭海萍,王兰.小麦面筋蛋白在食品工业中的应用J.西部粮油科技,2003,(1):32-33.3 Maningat C.C.,DeMeritt G.K.,JR.,Chinnaswamy R.andBassi S.D.Properties and Applications of Texturized wheat G1utenJ.Cereal Foods world,1999,44(2):650.4 魏本军.谷朊粉在面包专用粉中应用研究J.粮食与油脂,2002,(6):7-8.5 王章存,康艳玲,聂卉.谷朊粉垓性研究进展J.粮油食品科技,2006(2):5-14.6 董晓慧.氨基酸螯合锌吸收、转运特点和影响因素的研究D.哈尔滨:东北农业大学,2001:20.7 万辉琴,张花荣,李霞,等.学龄儿童锌营养状况及对智力的影响调查J.中国误诊学杂志,2008,8(10):2517-2518.8 张伟,陈志虹.氨基酸螯合锌的营养及应用研究进展J.饮料博览,2001,(11):10-13.9 朱璘,颜天华,王秋娟.有机螯合锌对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响J.微量元素与腱康研究,2002,1(4):7-9.10 邓尚贵,杨柒,秦小明.低值鱼蛋白多肽一铁()螯合物的酶制备及其抗氧化、抗菌活性研究J.湛江海洋大学学报,2006,26(4):4-58.11 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