体内化学交联和质谱分析法证实蛋白质相互作用.doc

体内化学交联和质谱分析法证实蛋白质相互作用蛋白复合体的分离可用不同的亲和色谱法。在经典的免疫亲和实验中，细胞裂解液中的蛋白复合体能被固定化了的抗体获取，该抗体识别复合体中已知成分的抗原决定簇。经过多次洗涤以去除非特异性结合蛋白，该复合体由质谱法分析（MS）。短暂性结合复合体，其解离常数高，不适合这种方法。本文通过一种新的方法，用体内化学交联和基于鉴定蛋白质的质谱分析法来鉴定瞬时作用的蛋白复合体。活细胞用甲醛处理，其快速蔓延到细胞膜，形成蛋白质-蛋白质化学交联。互作蛋白质交联到一个含有Myc标签的蛋白质上，通过免疫亲和层析共同纯化出来，再把分离下来。通过SDS-PAGE分离后，再用串联的质谱分析鉴定。利用这种方式我们证实了大量的与M-Ras组成激活形式共同被纯化下的蛋白质。在这些蛋白中，我们证实了RasGAP相关蛋白IQGAP1，它是与M-Ras相互作用的一个新的蛋白质。这种方法适合多种蛋白，对研究蛋白质相互作用十分有益。简介蛋白质互作几乎是细胞内每个功能水平都出现的，包括亚细胞结构，各种细胞膜的机械转运，染色体包装，基因表达调控，细胞内信号传导。蛋白质互作异常将导致很多种疾病，所以对蛋白质互作的研究成为生命科学领域极为紧迫的一件事。蛋白质复合体的纯化可以应用多种方法，包括经典的分子筛和凝胶过滤，以及这个不同的亲和色谱法分离。免疫亲和的方法是目前最具说服力的纯化方法，通常用于证明体内蛋白质互作和复合体中相互作用的物。一个经典的免疫亲和实验中，细胞裂解液中的蛋白复合体能被固定化了的抗体获取，该抗体识别复合体中已知成分的抗原决定簇。经过多次洗涤以去除非特异性结合蛋白，该复合体由质谱法分析。这种方法的缺点是，对感兴趣的蛋白质需要一种特异的抗体（Ab），许多时候这种亲和导致纯化效率很低。Ab除了和靶蛋白外的其他蛋白交联是另一个缺点。这时，与靶蛋白不相关的蛋白或蛋白复合体被纯化下了，导致假阳性。通过抗原决定簇标签把抗原结合到特异的抗体上，形成普通的抗体。为此，需要一个带有抗原决定簇标签的抗体和一个高亲和力的抗原。通用的标签有Myc，Flag，相应抗体已经被商品化。操作说明被标准，不要求每一部都在最适合的条件。虽然抗原决定簇标签适用于大范围的纯化实验，但是其局限于稳定的复合体。结合较弱的或者瞬间结合的复合物会被忽视，进而不能被分析出来。短暂性结合复合体，其解离常数高，在洗脱非特异结合条带时被洗脱下来。这些步骤不要严谨操作，在高盐或洗涤剂浓度时效率高。在温和条件下，重复洗涤也将洗脱掉结合不紧密的成分。 通过化学交联可以阻止蛋白质复合体特异组分的丢失。有效地化学交联剂是甲醛。甲醛的几个特点应用于蛋白质互作的研究。1，交联发生在近距离（2A），被交联的蛋白位置很近。2，甲醛可以扩散到细胞膜且是非特异的，有益于广谱的蛋白互作研究。3，甲醛几乎在添加到细胞内后阻止酶反应，可以提供添加时瞬间的互作情形。4，一旦交联反应完成，反应物可用于非生理条件下操作，并保持结构完整性。另外，交联是可逆的，可以随后分析复合体组分。甲醛温和处理和免疫沉淀在分析转录因子，与染色体结合的多聚配合物，核小体位置的确定，核小体动力学和核小体再构建方面。最近，甲醛交联与免疫沉淀和Western杂交结合，成功分析了，在酵母里是否TATA结合蛋白，TF IIB，SAGA组氨酸乙酰转移酶是否直接与转录结合蛋白结合。最近，作者在哺乳动物细胞中，采用了新的分析蛋白质互作方法，即甲醛交联结合免疫亲和层析，基于质谱分析的蛋白鉴定。利用这种方式我们证实了大量的与M-Ras组成激活形式共同被纯化下的蛋白质。共免疫沉淀和Western杂交证实很多蛋白互作。在这些蛋白质，我们证实了RasGAP相关蛋白IQGAP1，它是与M-Ras相互作用的一个新的蛋白质。进一步研究去解释其互作的生物学功能。2材料与方法2.1 抗体与试剂抗Myc的小鼠抗体mAB（clone 9E10）来自于H. Ziltener博士。抗IQGAP1和抗Rac的小鼠抗体是购买于BD生物科学公司。抗Rap1的兔多克隆抗体购买于Santa Cruz生物技术公司。羊抗鼠和羊抗兔的二抗来自DAKO公司。羊抗鼠Alexa Fluor 680二抗来自分子探针公司。另外的试剂来自Fisher Scientific。2.2 细胞系和细胞培养R6X细胞（依赖于白介素3双点位的鼠肥大细胞/巨噬细胞系）感染双顺反子逆转录病毒载体基于pMXpie，其稳定表达绿色荧光蛋白和天然的M-Ras和突变的组成型激活M-Ras，它们都带有氨基端的Myc标签。R6X细胞在37,5%CO2，RPMI1640培养基中加2mm的l谷氨酸盐，100单位/ml的青霉素，50ug/ml的链霉素，10%胎牛血清，2%的10倍的培养基，在WEHI-3B没有的作为白介素3的来源。2.3甲醛交联？收集R6X细胞，用PBS洗，每5*106个细胞在1ml的PBS（含0.125-1.0%多聚甲醛质量体积比）中孵育。甲醛交联在37,5-60分钟。反应终止是加入起始浓度为1.25M的甘氨酸，抑制浓度为125mM，室温，5分钟。细胞收集，PBS洗两次，在裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 甘油, 1% NP-40, 5 mM EDTA）中打散沉淀物，裂解液中加入蛋白酶抑制剂。细胞裂解物在14000rpm，15min成为细胞颗粒碎片。收集上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量检测蛋白质量。3.4 Western杂交和免疫沉淀反应蛋白在10% SDS-PAGE中被分离，并转到硝酸纤维素膜上，膜在4，3%的BSA过夜封闭，室温一抗孵育1小时，PBS中加入0.1%的吐温洗涤四次，室温二抗孵育1小时。在一轮洗涤后，条带在化学发光剂和X射线胶卷或奥德赛红外成像系统中被看到。免疫沉淀反应，2mg抗Myc的抗体用邻苯二甲酸二甲酯偶联到1ml的蛋白G琼脂糖珠子上，细胞裂解液用25-50ml蛋白G琼脂糖珠预处理，4,10min，含有1mg的处理裂解液在25-50ul的含抗Myc的抗体琼脂珠，4，2h。裂解液用buffer洗涤三次，结合材料再用1m甘氨酸（pH2.5）37,15min。用饱和Tris溶液再次洗涤。洗涤样品中加入5倍的样品buffer（2%SDS, 10%甘油, 40%mMTris pH 6.8, 715 mM b-巯基乙醇稀释成1倍），65煮10民，以备SDS-PAGE。2.5 免疫亲和层析多聚甲醛处理的细胞裂解液约需109R6X细胞，含有标准化保证岂有相同的蛋白数量。免疫亲和层析实验中，0.864 cm Poly-Prep柱子中1ml抗Myc抗体的柱子。在纯化之前，细胞裂解液用1ml的蛋白G琼脂珠预处理，4,10min。预处理的裂解液加入免疫亲和层析柱子中，4，2小时。柱子用10ml平衡buffer（20 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mMEDTA）洗脱，第2次用10ml含1%吐温20平衡buffer洗脱，第3次用10ml含500mM NaCl平衡buffer洗涤。结合材料用1m甘氨酸（pH2.5）37,15min。用饱和Tris溶液再次洗涤。把三次的纯化也收集在一起，用Amicon Ultra-4 10 000 MWCO过滤器离心，。在浓缩的样品中加入5倍的上样buffer，95煮20min。蛋白质在10%SDS-PAGE中分离，用考马斯亮蓝染色法观察。2.6多维液相层析/串联式质谱法分析蛋白条带从SDS-PAGE中切割下来，胶内进行胰蛋白酶化。按序蛋白酶化在37过夜。提取多肽，到新管中，加入10ul 5%的甲酸用多维液相层析/串联式质谱法分析。流入的液相色谱用最终高效液相色谱系统，流速为200nl/min用75 mm6150 mm RP毛细管柱，用水/CAN/甲酸为梯度。液相色谱流出液电喷入QSTAR quadrupole-TOF质谱仪的样品孔。收集串联质谱仪收据。串联质谱仪用MASCOT搜索引擎，收据分析和对比所有的哺乳动物序列（Swiss-Prot数据库）。3 结果与分析3.1 体内M-Ras化学交联甲醛是一种可逆的有效地蛋白交联试剂。据此，我们研究甲醛对Ras家族（小GTP酶M-Ras）化学交联效果。M-Ras,好家族中其他成员像类似，以结合GDP或GTP决定分子的开关。当结合GTP时它可以绑定下游效应物激活下游反应。至今，M-Ras几个候选效应物已有酵母双杂交证实，包括RPM, Nore1, AF-6, Rin1, RalGDS, Raf-1, and A-Raf。M-Ras具有很多调节物，有p21Ras蛋白特性，H-Ras，N-Ras，K-Ras。鸟嘌呤交换因子(GEFs)，促使GDP释放，阴性调节剂包括GTP激活蛋白(GAPs)，是Ras与GTP结合，并增强GTP酶活性，导致失活状态构想变化。已知的M-Ras的效应物不能说明其功能，体内与其相互作用的物质应该解释其细胞功能，包括，生长，分化和瘤形成。本文的目的是寻求一种普遍的方法来鉴定蛋白质的互作，方便我们的研究。通过甲醛处理，作者认为可以交联到带有抗原决定簇标签的靶基因的互作蛋白。与靶基因互作的基因可以通过已知基因的抗体把互作基因共纯化下来。纯化的复合物通过SDS-PAGE纯化出来，通过多维液相层析/串联式质谱法分析R6X细胞表达带有Myc标签的组成型激活M-Ras突变体，用某种浓度的多聚甲醛处理20min，包含M-Ras用Western分析（Myc抗体），M-Ras约在29kDa处，在1%多聚甲醛处理后其上方约50kDa处有两条明显的条带。随着多聚甲醛浓度从0.125%到1%增加，这两条带越来越明显，表面M-Ras至少和两条蛋白交联，大小约20kDa。由于不溶性沉淀出现在细胞裂解物中，所以没有测定更高浓度的多聚甲醛。除了上面的条带外，约37kDa的条带在Western（抗Myc的抗体）中一直被发现，为了选择1%多聚甲醛的最适作用时间，做了一组选择最适时间的试验。孵育时间在10,20min时M-Ras复合体的产量高。条带弥散表明杂交时间太长。因此过度的杂交，则会造成抗原决定簇位点的掩盖，这是由于赖氨酸或其他由于甲醛作用的位点扩大化。最后把1%多聚甲醛，20min固定作为体内M-Ras交联的最适条件。R6X细胞中表达pMXpie空载体，M-RasQ71L(突变)，M-RasWT，通过交联与非交联用Western杂交观察M-Ras表达量。多聚甲醛交联后用红外成像系统观察到多余复合物的出现。这些复合物表达量较低，大小在65kDa到250kDa.只是在突变的表达载体中看到的，因为突变的载体处于激活状态，其效应物和负调控因子与其结合，增加了蛋白含量。3.2 免疫亲和纯化与M-Ras交联的蛋白为了鉴别与M-Ras Q71L(突变)结合的蛋白，需要纯化出足够的复合体以供质谱分析。所以我们需要对地表达量的条带进行富集。起初，作者想用商业化的抗Myc的亲和树脂来小范围的纯化大量的SDS-PAGE中观察到的条带。虽然富集量很大，通过Western杂交显示仍不够。按比例增加反应量，合并收集液，收益很小，且增加了非特异条带。为此，作者采用免疫亲和层析大范围纯化复合体。柱子上灌入亲和树脂，其共价结合抗Myc的抗体的蛋白G琼脂糖珠。纯化之前，细胞裂解液先于蛋白G琼脂糖珠处理，然后，与亲和树脂孵育。经过洗涤后，结婚有复合体的珠子用低pH的洗提也洗，然后立即从新洗涤以免蛋白质被破坏。在进行蛋白分离之前，甲醛交联复合体先复兴即从新解离。甲醛是与主链氨基上的赖氨酸残疾反应形成交联，解交联将会抑制，1)凝胶被溶解时，多肽链形成。胰蛋白酶消化位点丢失。2）残留物中含有多个位点参与化学交联3）来自不同蛋白的多肽用胰蛋白酶消化。几种解交联地方法，我们选择了Hall et al，样品在5*SDS-PAGE中煮沸20min，用Weste