微生物实验(讲义).doc

环境微生物学实验昆明理工大学环境科学与工程学院环境微生物学实验课: 环境微生物学实验课是培养未来环境科学工作者掌握有关环境微生物学基本实验方法和技能的一门必修课。其包括微生物制片及染色技术，观察培养微生物的方法，培养基的配制与灭菌，纯种分离与接种技术等实验。是训练和培养学生进行独立工作能力的重要环节。环境微生物学实验从加强基础，培养能力，提高素质的教学目标出发，在现有的条件下，以基本操作，基本技能和基本理论为基础，精选、重组验证性实验，力求建立一个既巩固课堂知识，增强感性认识，又具有相对独立性的实验体系。在培养学生动手能力的同时，理论与实验相结合，培养学生独立思考问题，综合分析问题和解决问题的能力。培养学生具有认真严谨的科学态度、创新意识和团队精神，全面提高学生的综合素质。本课程的任务：1.实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。2.与环境微生物学基础理论课紧密结合，使学生进一步加深理解环境微生物学课的理论知识，将书本知识用于实验，培养学生观察、思考及独立分析问题和解决问题的能力，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。3.根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。实验要求：1)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；2)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；3)树立密切合作的风气，包括学生与老师、组与组、组长与组员之间的密配合。熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，由于微生物学实验结果的观察有的需几天后再观察，这样学生需常到实验室来，花费时间较多。环境微生物实验课的目的是训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：1、每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。2、认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。3、实验室内应保持整洁、勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。4、实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。5、实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。6、使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。7、每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐。擦净桌面。8、每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。9、每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅。10、离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。实验一、光学显微镜的使用和原核微生物个体形态观察一、实验目的：1、了解普通光学显微镜的构造和原理，并正确掌握使用显微镜的方法。2、学会压滴法制片3、了解细菌的形态及特殊结构4、掌握生物图的绘制方法二、光学显微镜的基本构造及使用光学显微镜是精密的放大仪器，是生物学研究不可缺少的工具。我们用它可以观察肉眼看不见的微小生物的结构。光学显微镜由机械部分和光学部分组成。光学部分中物镜是较为重要的部件。每个物镜上都有放大倍数、数值孔径及所要求盖玻片厚度等主要参数。聚光器的作用是把光线聚集到标本上，增强照明度。目镜是起放大镜的作用。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因： 1. 增加照明亮度 油镜的放大倍数可达 100 ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。 2. 增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=/2N.A，式中= 光波波长； NA= 物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4-0.7 m ），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n sin 式中为光线最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等物镜（ NA 都低于 1.0）。若以可见光的平均波长 0.55 m来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4m的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 m 左右。（一）基本构造：机械部分：1. 镜筒 为显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装目镜，下端与物镜转换器相连。作用是保护成像的光路与亮度。2. 转换器固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。转换器上有24个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜。3. 粗准焦螺旋位于镜痤的两侧，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距。4. 细准焦螺旋位于镜痤的两侧，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距。5. 镜座是位于镜臂的下方，显微镜的底部，用以稳固和支持镜身，在镜座上有一旋纽，可用来调节光源的强弱。6. 镜柱从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。7. 倾斜关节镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45）便于观察。8. 载物台从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属夹片夹，用来夹住载玻片。在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上前后左右移动。光学部分：1.目镜它是安装在镜筒上端的镜头。是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，上面刻有10或16符号以表示其放大倍数。2.物镜是决定显微镜质量的关键部件。安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。装在镜筒下端的旋转器上，一般有4个物镜，其中刻有“4”和“10”符号的为低倍镜，较长的刻有“40”符号的为高倍镜，最长的刻有“100”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm) 10 0.25 5.40 40 0.65 0.39 100 1.30 0.11表中的工作距离是指显微镜处于工作状态(物象调节清楚)时物镜的下表面与盖玻片(盖玻片的厚度一般为0.17mm)上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10，目镜为10，其放大倍数就为1010=100。3.反光镜在聚光器的下面有一个一面平另一面凹的双面圆镜。可作各种方向的翻转，光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜。(过去老式的显微镜有反光镜，它是用来提供光源的；现在的显微镜是用灯泡来提供光源的。)4.聚光器 是由凹透镜组成的，它可以集中反光镜投射来的光线。在镜柱前面有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强。5.虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成，在较高级的显微镜上具有此装置。使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度。虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调。6.遮光器简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而装有遮光器。遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）。光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱。（二）显微镜的使用1. 取镜安放取镜 右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立。（特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜筒中滑脱）。安放 放置桌边时动作要轻。一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂向后，距桌边710 处，以便观察和防止掉落。2通电接通电源，转动转换器，使低倍物镜正对通光孔。调节两个目镜的孔距以便在目镜里看见一个圆形、明亮的视野。3低倍镜的使用观察任何标本都必须先用低倍镜。（1）放置切片升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用夹片夹压住载玻片的两端。（2）调焦两眼从侧面注视物镜，转动粗准焦螺旋，让载物台缓缓地上升，至物镜距玻片25 处。同时用手反方向（逆时针方向）转动粗准焦螺旋，直到看清物像为止。如果不够清楚，可用细准焦螺旋调节。（注意不要压碎载玻片。）（3）低倍镜的观察 由所用的目镜放大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数。如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节。4 高倍镜的使用（1）选好目标 先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央。转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜。（用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片）。（2）调焦 在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像。在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度。5油镜的使用使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：(1)、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。(2)、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。(3)、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。(4)、从目镜内观察。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。(5)、观察完毕，关毕电源，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。(6)、将各部分还原，转动物镜转换器，使4x物镜头与载物台通光孔相对，用柔软纱布清洁载物台等机械部分，将显微镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。三、仪器与材料仪器：光学显微镜、 洁净工作台材料：示范片、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、二甲苯、擦镜纸、香柏油、蒸馏水器皿：载玻片、接种环、盖玻片、废弃缸、酒精灯、打火机四、实验内容及操作步骤1用显微镜观察示范片（1）打开光源（2）放置标本将示范片放在载物台上，用玻片夹夹牢，移动载物台推进器使欲检部位位于物镜正下方。（3）调焦、观察先用低倍镜观察，转动粗螺旋调节器，调至物像出现，再用细螺旋调节器调至物象清晰为止，找到最适宜观察部位后，移至视野中心，再换用高倍镜观察。（4）用毕后的处理观察完毕，下降载物台，取出载玻片，关闭电源，将物镜转至低倍镜。用擦镜纸擦目镜，再将显微镜用罩子罩上。2用显微镜观察自制片（1）在载玻片中加一滴蒸馏水，（2）用接种针以无菌操作取少许大肠杆菌菌体于蒸馏水中，（3）取一块盖玻片，将其一端接触水滴，慢慢放下，盖在大肠杆菌悬液上，勿使产生气泡，（4）用显微镜观察大肠杆菌的形态，步骤同1。五、实验结果1、绘制所观察到的示范片中的原核微生物形态2、查阅相关资料绘制以下微生物的形态：capsule, endospore, flagella.Bacillus, Rhodospirillum, Escherichia, Diplococcus, Zoogloea.Actinomycetes六、思考题1、反复练习使用低倍镜及高倍接物镜观察切片，使用时应特别注意什么问题？2、如何计算显微镜的放大倍数？你现在所用的显微镜可以放大多少倍？29实验二、制片及真核微生物个体形态的观察一、实验目的：1、熟练掌握显微镜的使用方法2、学会真菌的简易制片法3、了解真菌的形态，掌握生物图的绘制方法二、仪器与材料仪器：光学显微镜材料：青霉、曲霉、根霉、载玻片、剪刀、镊子、胶带纸、棉蓝、废弃缸三、实验内容及操作步骤1真菌的简易制片法（1）在洁净载玻片上，滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液l滴。（2）剪取一小块透明胶，一端用镊子夹取，打开培养好真菌的培养皿盖，用透明胶轻轻粘取真菌菌落表面，轻放在载玻片上的乳酸石炭酸棉蓝染色液中，以赶走菌体上的气泡。（3）加盖玻片，用显微镜进行观察，注意观察真菌的形态。2真菌的观察及绘制（1）打开光源（2）放置标本将制好的真菌载玻片放在载物台上，用夹片夹夹牢，移动载物台推进器使欲检部位位于物镜正下方。（3）调焦观察先用低倍镜观察，转动粗螺旋调节器，调至物像出现，再用细螺旋调节器调至物象清晰为止，找到最适宜观察部位后，移至视野中心，再换用高倍镜观察。（4）用毕后的处理观察完毕，下降载物台，取出载玻片，关闭电源，将物镜转至低倍镜。用擦镜纸擦目镜，再将显微镜用罩子罩上。四、实验结果1、绘制所观察到的青霉，曲霉，根霉形态。2、查阅相关资料绘制以下微生物的形态：Fusarium, Nematode, 藻类，原生动物实验三、微生物细胞数的计数一 实验目的了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。二 实验原理1、 血球计数板的结构血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中格（中格之间用双线隔开），而每个中格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中格（中格之间用双线分开），而每个中格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。已知：1ml体积=10 mm10 mm10 mm= 1000mm3所以：1ml体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4106个小方格，即系数K=4106 。因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）系数（K）菌液稀释倍数（d）2、 使用血球计数板计数计算公式如下：1625计数板：总菌数/ml=40010000稀释倍数=每个小方格内菌数4106稀释倍数2516计数板：总菌数/ml=40010000稀释倍数=每小方格内菌数4106稀释倍数三、材料和器皿材料：酿酒酵母、显微镜、血球计数板、盖玻片器皿：移液管、枪头四、实验内容及操作步骤1 总菌计数法(1)检查血球计数板 取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。 (2)稀释样品 将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含45个菌体的稀释度为宜。 (3)加样 取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置510分钟。 (4)镜检 静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。每个样品重复3次。 (5)计算 取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。 菌体细胞数（cfu/mL）小格内平均菌体细胞数400104稀释倍数 (6) 清洗 计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。(7) 测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。五、实验结果中格五中格平均值稀释倍数X1X2X3X4(X5)第一次 1第二次1六、思考题:为什么用两种不同规格的计数板测定同一样品时,其结果一样?实验四、培养基的制备及灭菌一、实验目的1、 了解玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作2、 掌握培养基和无菌水的制备3、 了解高压蒸气灭菌锅的结构、原理及学会使用二、高压蒸气灭菌锅的原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，是灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效果。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于冷空气的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。三、仪器与材料仪器：高压蒸气灭菌锅、天平、烘箱、洁净工作台材料：牛肉膏蛋白胨培养基试剂：NaOH器皿：三角瓶、试管、硅胶塞、量筒、玻棒、烧杯、精密pH试纸、药匙、分装漏斗、试管盒、纱布、报纸、麻绳、标签、培养皿等四、实验内容及操作步骤1玻璃器皿的洗涤及包装为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。（一）器皿洗涤的注意事项和方法（1）任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，所以不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。（2）一般新的玻璃器皿用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水冲洗干净。（3）用过的器皿应立即洗涤，有时放置太久会增加洗涤困难。（4）难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起。有油的器皿不要与无油的器皿放在一起，否则使本来无油的器皿也沾上了油垢，浪费药剂和时间。（5）强酸、强碱、琼脂等腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废缸内。（6）含有琼脂培养基的器皿，可先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮去，或把它们用水蒸煮，待琼脂融化后趁热倒出，然后用水洗涤。（7）一般的器皿都可用去污粉、肥皂或配成5%热肥皂水来清洗油质很重的器皿，应先将油层擦去。（8）如果器皿沾有煤膏、焦油及树脂类的一些物质，可用浓硫酸或40%的氢氧化钠液洗，或用洗涤液浸泡。（9）当器皿上沾有蜡或油漆等物质，用加热方法使之融化揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、丙酮、松节油等）拭揩。（10）洗涤后的器皿达到玻璃能被水均匀湿润而无条纹和水珠。（11）载玻片或盖玻片可先在2%盐酸溶液中浸1小时，然后在水中冲洗23次，最后用蒸馏水洗23次，洗后烘干冷却或浸于95%酒精中保存备用。用过的载玻片或盖玻片，先擦去油垢，再放在5%肥皂水中煮10分钟后，立即用清水冲洗，以后放在洗涤液（稀释）中浸泡2小时，再用清水洗至无色为止，最后用蒸馏水洗数次，干后浸于95%酒精中保存备用。（12）凡遇有传染性材料的器皿，洗涤前应经高压灭菌后清洗。（二）器皿包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需包扎。（1）培养皿 洗净烘干后每12套迭在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在无菌室中才打开取出培养皿。（2）吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约45厘米，以45左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。（3）试管和三角瓶 试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。（4）若干试管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。2、制备培养基（1）计算称量 根据牛肉膏蛋白胨的配方，牛肉膏 3克, 蛋白胨10克, 氯化钠 5克, 琼脂20克, 水 1000毫升, pH=7.0-7.2。计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。 （2）溶解 一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想)。加热溶解时，要不断搅拌（本实验培养基的配制不需加热溶解）。如有琼脂在内，可先将称量好的琼脂先放入三角瓶中,实验时可先将药品放入烧杯中溶解,之后定容,再调节pH值,之后再将该溶液倒入装有琼脂的三角瓶中。 （3）调节pH 用滴管逐滴加入NaOH或HCl边搅动；边用精密的pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止。pH值也可用pH计来测定。 （4）过滤 可用四层纱布过滤。之后将配制好的溶液加入三角瓶中，先用四层纱布盖好三角瓶瓶口，再用报纸盖在其上，最后用橡皮筋固定。3、斜面培养基的制作将配制好的牛肉膏蛋白胨培养基放在电炉上加热,将琼脂完全溶解,趁热放入漏斗中进行分装,每支试管的量约2-5毫升.试管灭菌后,趁热斜置在木棒上,使试管内的培养基斜面长度为试管长度的1/3-1/2之间,待培养基凝固后即成斜面.4、灭菌（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121，20-30分钟灭菌。（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。（6）将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。5、 倒平板右手持盛有培养基的三角瓶置于酒精灯火焰旁边，用左手将试瓶塞轻轻地去（拨）出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15-20 ml培养基至培养皿中，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。五、注意事项：1、 加水：向锅内注入适量的水。 2、 装锅：注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3、 排气： 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。4、 冷却：让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀。 5、 干热灭菌：一般在电烘箱中进行。干热灭菌所需温度较湿热灭菌高，时间也较湿热灭菌长。这是因为蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固。一般须在160左右保持恒温34小时，方能达到灭菌的目的。干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，凡带有橡胶的物品和培养基，都不能进行干热灭菌。切断电源，冷却到60时，才能把箱门打开，取出灭菌物品。六、思考题1、为什么温热比干热灭菌优越?2、培养基中加琼脂的作用是什么?3、如何检验培养基灭菌是否彻底?4、灭菌结束之后，为什么要等压力降到“0”后才能打开放气阀？实验五、细菌纯种分离、培养及接种技术一、实验目的1、掌握从环境中（土壤、活性污泥、垃圾等）分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能2、了解斜面、平板接种技术二、材料和器皿材料：大肠杆菌、接种环、无菌试管、无菌移液管、枪头、涂布棒、酒精灯、打火机、三角瓶、试管架、记号笔器皿：牛肉膏蛋白胨培养基平板仪器：恒温培养箱、洁净工作台三、实验内容及操作步骤1、稀释平板涂布法（1）在含100 ml无菌稀释水和玻璃珠的锥形瓶中加入土样10g，振荡10min，制成土壤悬浮液。（2）将土壤悬浮液作10倍递减稀释至适当浓度。（3）取最后3个稀释度，通常细菌取10-410-6，放线菌取10-310-5，霉菌取10-210-4。以平皿倾注法（混菌法）或平板涂布法（刮刀法）接种于合适的培养基，每个稀释度做3个平行。注意所用吸管在每次吸取悬液时，应在稀释液中反复吹吸3次5次，使悬液中微生物分布均匀，并避免因管壁吸附而造成误差。（4）培养:混菌法待培养基冷凝后，涂布法待接种悬液被培养基吸收后，倒置于温箱适温（28 30 ）培养，细菌1d2d。（5）计数: 经培养适当时间后，取出平皿，计数平板上出现的菌落。细菌和放线菌选取菌落数为30的平皿到300的平皿，真菌选菌落数在10的平皿到100的平皿，片状菌苔占平板表面15以上的平皿应舍去，因为它们抑制了其他菌落的正常发育而造成误差。（6）计算每克土样含菌数。（7）划线纯化: 涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。涂布分离细菌的平板，温箱培养2d3d后，于室温下放置3d或2d，使菌落性状表现较充分，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。2、平板划线分离法通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。操作方法（三区划线法）（图1）：（1）右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。 （2）左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。 （3）接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。 （4）第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。 （5）划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，倒置37温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。3、几种接种技术操作（1）斜面接种技术具体操作如下： A、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。 B、点燃酒精灯。 C、接种 用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序简述如下： a手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间部位。斜面向上，并使它们位于水平位置。 b旋松棉塞 先用右手将棉塞旋松，以便接种时拔出。 c取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌(图1)。 d拔棉塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫) (图2、3)。 e环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。 f取菌种 待环冷却后轻轻沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰(图4)。 g接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点(图5)。 h塞棉塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气(图6)。i环灭菌 将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。(2)划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。(3）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。(4)穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。(5)浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。(6)涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。(7)液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。四、观察并记录实验结果1824小时后到实验室观察平板划线分离法和稀释涂布分离法的结果。观察并记录培养基表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。五、思考题1、分离土壤中的微生物为什么要稀释?2、用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始?为什么?3、如果要从环境中分离得到能利用苯胺作为碳源和能源的微生物纯培养物，你该如何设计实验？实验六、细菌淀粉酶及过氧化氢酶的测定一、实验目的通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶的感性认识。二、原理细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖。过氧化氢酶能将过氧化氢分解为水和氧气。三、材料和器皿材料：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、碘液、3%-5%过氧化氢液、试管架、接种环、酒精灯、打火机器皿：牛肉膏蛋白胨加淀粉的培养基平板、牛肉膏蛋白胨培养基的试管仪器：恒温培养箱、洁净工作台四、实验内容及操作步骤（1）细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验a) 将牛肉膏蛋白胨加淀粉的培养基加热融化，待冷至45度左右倒入无菌培养皿内(每皿约10毫升) ，共倒2个，静置待冷凝即成平板。b) 在无菌操作条件下，用接种环分别挑取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌各一环分别在2个平板上点种5个点。倒置于37度恒温箱内培养1天。c) 观察结果,取出平板，分