MicroRNAs-27b(mir-27b)的生物学.doc

MicroRNAs-27b(mir-27b)的生物学 1.概述 MicroRNAs (miRNAs) 是高度保守的、非编码小RNAs，其长度为21-23个核苷酸。miRNAs的主要功能是在转录后水平调控基因表达通过抑制mRNA转录蛋白或促进mRNA的降解7-9。大多数已知的miRNAs位于内含子内，其表达与宿主基因的mRNA的转录平行。虽然内含子的miRNA和它们的宿主基因可以独立地调节，内含子miRNA仍然可以通过靶向宿主基因的非翻译区（UTR）下调其翻译的编码蛋白质的基因5。少数miRNAs则起源于RNA外含子或者非编码的RNA区域4-5。近来有报道指出内含子miRNAs可能不受宿主基因的调控而独立调控转录单元6。2. Mir-27b的生物学功能2.1 Mir-27b的生物合成 miRNAs经过RNA聚合酶7及RNA聚合酶8复合物催化，成熟的miRNAs来自pri-miRNAs转录后紧接着的两步切割。这两步都由RNAse催化双链RNA结合因子完成。首先Drosha and DGCR8 (Pasha)与核的多蛋白相关联的微处理复合体，介导切割转录后的原始miRNA成为，大约70个核苷酸片段长度的前导miRNA（pre-miRNA）9-12。DGCR8 在底物识别中发挥重要作用13。 第一步处理过程已经定义了一个最终miRNA/miRNA*的序列的结束，而且极有可能在转录时已出现14。一些内含子miRNAs Drosophila and C. elegans 在拼接上呈现先驱miRNA特征，同时并不需要Drosha-介导的切割15。在第二步处理过程，先驱miRNA被Exportin-5核孔复合体从细胞核中转移至细胞浆中16-19。在细胞桨中，Dicer 引导第二步过程，将miRNA/miRNA*双链体从先驱miRNA中释放20-21。Dicer酶的作用在果蝇属由双链RNA结合因子(Loqs)/R3D1-L 促进，而在哺乳动物则由TRBP 和 PACT促进22-25。Dicer和TRBP很可能促进Ago2装载包含RISC装载复合体在内的所有的三个因素26。miRNA/miRNA*双链体有一个二核苷酸悬突在3，端和一个自由磷酸基在5，端，这是核糖核酸酶裂解产物的特点。2.1 Mir-27b的序列 Mir-27b的成熟体是发挥生物学功能的重要片段，miRBase与2013年公布了15种动物的mir-27b的成熟体序列，并标记出在整个序列中的位置。2.2 Mir-27b与血管新生血管新生出现在生长、组织修复或疾病发生时，其过程为内皮细胞出芽（内皮细胞从原有的管壁逃离）、迁移和增殖39。特异的内皮细胞称为根尖细胞，位于生长管壁的顶端，引导内皮细胞出芽40。迁移根尖细胞受生长因子-VEGF和bFGF的作用下调控新的血管萌芽。内皮细胞对细胞外微环境和来自内皮细胞相关的miRNAs的刺激非常敏感，因此它们可微调血管新生过程。大量的证据表明miRNA是血管新生的重要调节者37。Mir-27b是mir-27家族的成员之一，其在内皮细胞内高表达。研究发现它在可体外调节内皮细胞出芽和增殖，同时在体内生物过程中促进血管的新生38.Mir-27b直接靶向作用于Semaphorin6A一个血管新生抑制剂，其拮抗Semaphorin6A对内皮细胞的抑制功能来调节血管新生过程。Urbich等采用转染、Luciferase cloning等一系列相关技术研究表明，miR-27a/b促进血管新生，并通过靶向作用于内生的血管新生抑制剂SEMA6A，调控内皮细胞发芽27。他们在建立的三维球体模型中发现，过表达的mir-27a/b明显地促进内皮细胞的发芽，适度增加血管内皮生长因子（VEGF）诱导下的迁移，同时mir-27b能增加每个球体的出芽量。他们接着利用发夹结构抑制剂抑制mir-27a/b表达，结果明显抑制了血管源性出芽，但并不影响内皮细胞的生存。体内外实验结果一致，抑制mir-27a/b，会降低血管在基底膜的分布和损害斑马鱼胚胎脉管的形成。他们在8周大的小鼠体内体内植入基质胶质，然后抑制mir-27a/b的表达,并测定血管新生，结果血管侵入基质胶的数量明显减少。Mir-27调控血管新生抑制剂semaphorin 6A (SEMA6A)，其作用于SEMA6A的3非翻译区域。他们采用western blot技术在蛋白水平分析，得出结论，过表达mir-27b抑制SEMA6A 和SEMA3B蛋白的表达。用siRNA转染内皮细胞使SEMA6A部分的沉默，结果逆转了mir-27a/b介导的内皮细胞出芽的抑制，并消除mir-27a/b介导的内皮细胞间的排斥。因此，他们认为SEMA6A是调节邻近内皮细胞间排斥相关的mir-27a/b的下游靶。Zhou Q1, Gallagher R等的研究表明Mir-232724在内皮细胞和高度血管化的组织富集。通过锁核酸修饰的抗miRNAs抑制剂抑制mir-23和mir-27的生物功能，将抑制体外的血管新生和出生后的视网膜血管的发育。mir-27促进血管新生通过靶向作用于Sprouty2 和Sema6A蛋白（发挥拮抗血管新生作用）来提高血管新生信号28。他们在新生小鼠视网膜建立miRNA功能缺失模型（血管造影模型），从小鼠出生后第二天开始，视网膜下注射miRNA拮抗剂LNA-antimiR-23/27，与正常组相比导致在视网膜大于90%的mir-23/27表达量。在拮抗4天后，与对照组相比，拮抗组的发芽的距离和血管覆盖均减少。在高倍镜下观察发现在拮抗组几乎没有血管芽形成。而mir-23/27靶向作用的蛋白Sprouty2、Sema6A和Sema6D，在拮抗模型中明显地被正向调节。他们建立激光诱导CNV小鼠模型。首先测定激光损伤后mir-23/27/24家族在视网膜/脉络膜的表达水平，并立即敲除视网膜中mir-23/27的含量，然后分注射mir-23/27组与非注射组。2周后收集视网膜，采用ICAM-2染色和共焦成像处理，发现注射组出现mir-23/27的正调控。通过对ICAM-2 染色的CNV面积定量化分析，发现注射组mir-23/27的沉默抑制CNV的面积大于50%。Wang JM1, Tao J 等的研究表明，在2型糖尿病大鼠模型中，mir-27b通过靶向抑制拮抗血管新生的蛋白TSP-1，恢复糖尿病大鼠损伤的内皮祖细胞（EPC）功能，同时促进伤口愈合29。他们发现Mir-27b拟态物提高ab/db 模型中BMAC的功能，包括增殖、粘附、管腔形成，和延迟凋亡，但却对其迁移没有影响。在ab/db BMACs的模型中提高TSP-1蛋白的表达，可抑制mir-27b拟态物的转染。在db/+ BMACs 模型中抑制mir-27b功能可减少血管新生，采用流式细胞仪及western blot的方法测定CD36 或CD47的表达，发现CD47是TSP-1的主要受体。通过荧光素酶报告系统分析表明miR-27b直接靶向作用于TSP-1/ TSP-2/ P66shc/ semaphorin6A 来恢复损害的骨髓源性血管生成细胞的功能，从而促进血管新生。他们建立腺病毒介导的siRNA转染使P66shc沉默模型，然后发现Mir-27b抑制P66shc和线粒体氧化应激反应，有助于保护BMAC的功能。在2型糖尿病小鼠中，mir-27b同样抑制semaphorin6A 的表达，从而保护BMAC的功能。Mir-27b提高糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的局部BMACs细胞愈合能力伴随伤口灌注的提高和毛细血管形成。而抑制了mir-27b功能的普通治疗则证明这减少伤口的愈合、灌注和毛细血管形成。2.3 Mir-27b与动静脉分化 动静脉结构的不同是由生理因素如血液流动的方向和压力，以及功能、解剖的差异如血管周围的平滑肌细胞的分布来定义的。动静脉功能的差异在于，动脉携带氧合血，并有紧密的内皮连接，同时静脉携无氧血，并有宽松的内皮连接30。最初认为影响动静脉分化的主要因素是血液动力学，但是近年来对胚胎循环的研究发现，在血液循环建立前动静脉分化就已经存在，并由不同的基因表达特征来决定 31-36。最近，动脉或静脉形成相关的内皮细胞已经被证实16。Biyashev等的研究证实miR-27b作为关键分子参与动静脉内皮细胞的分化，通过调控EfnB2, EfnB4,Flt1 and Flt4的表达。他们进一步证实PEDF(色素上皮细胞衍生因子)-一种内生的血管新生抑制素，通过正向调节DII4和Spry2蛋白来负调节miR-27b，从而抑制血管新生和影响动静脉分化。研究者建立斑马鱼模型和LLC小鼠侧翼肿瘤模型模拟肿瘤生长血管生成，并采用miRNA expression microarrays、Northern blot analysis、Western blot analysis、Luciferase reporter assay等实验方法分析，发现miR-27b在决定尖端细胞出芽方面发挥重要作用，并与静脉分化有关。他们还通过建立MO-Dll4和MO-Spry2模型，证明miR-27b靶向作用Dll4 and Spry2。而Dll4 and Spry2被证实与血管引导、分支的管状结构形成和进一步的发芽相关14-15。miR-27b通过使Dll4 and Spry2表达沉默而在转录后水平起作用，促进血管的出芽和静脉分化。阻断Dll4和Spry2破坏动脉分化，增加静脉标记物的表达。Spry2的沉默进一步使FLt4升高静脉分化的另一个决定因素。更为重要的是敲除Spry2或DLL4的活性,恢复了因miR-27b沉默导致的在斑马鱼和老鼠血管外植体中的显型。因此，他们认为mir-27b在血管模式中起关键作用和血管生成平衡中居核心位置其通过促血管新生因子被上调，而抗血管生成蛋白将其下调。3 Mir-27b与疾病3.1Mir-27b与肿瘤 Ye J, Wu X等的研究表明在大部分直肠癌组织里mir-27b表达降低，而过表达mir-27b抑制直肠癌细胞增殖，菌落形成和肿瘤在体内外的生长41。他们采用Microarray analysis及qPCR的分析方法发现mir-27b相比于在其他肿瘤中表达升高，在直肠癌肿瘤中表达下降。他们通过SW620细胞培养及皮下注射直肠癌细胞发现，过表达mir-27b抑制细胞增殖、形成和抑制肿瘤生长。他们证实了VEGFC与mir-27b的关系。并确定了mir-27b的功能作为肿瘤生长的抑制剂和靶向作用于VEGFC促进血管新生。 他们建立了VEGFC敲除、shRNA抑制剂拮抗mir-27b的SW620细胞模型。这个模型结果证明VEGFC在促进癌细胞增殖和肿瘤发生方面发挥重要作用，同时证实VEGFC是mir-27b的功能下游靶点。3.2Mir-27b与脂肪形成 Qun Lin等的研究表明，过表达mir-27明显抑制脂肪细胞的形成，并通过阻断成脂调控的两个关键因素PPAR和C/EBP的表达发挥作用42。同时其在脂肪细胞形成之前或之时发挥效应。Qun Lin等首先采用检测miRNA 表达芯片技术，通过在3T3-L1成脂模型中检测miRNA的表达，发现mir-27基因家族在脂肪生成过程中下降明显。然后在刺激脂肪细胞前，将微小RNA前体分子短暂转染3T3-L1皮下脂肪前体细胞中的mir-27a或mir-27b，利用实时定量PCR技术检测发现， 60-fold的成熟mir-27a或mir-27b表达的增加。说明成熟mir-27a或mir-27b在3T3-L1皮下脂肪前体细胞中强效抑制脂肪生成。而在3T3-L1成脂模型中，利用western blot的技术检测蛋白水平，qRT-PCR技术分析mRNA表达水平。结果数据表明mir-27通过阻断成脂关键基因CEBP和PPAR的转录抑制成脂分化。4. 展望 MiR-27b在调节血管新生过程中发挥关键作用。其使促进或抑制内皮细胞的增殖、迁移、分化的因素达到一个良好的平衡。我们预期未来的研究将进一步发现证实miR-27b在调节与血管新生有关的其他类型细胞的功能方面发挥的作用，例如周皮细胞。肿瘤相关的内皮细胞揭露DII4和Spry2的表达上升与miR-27b的抑制有关。因此，使用微