2010分子生物学要点1.doc

核酸琼脂糖凝胶电泳 常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。 (一) DNA碱基组成的Chargaff规则 (二) DNA的二级结构 依据：Chargaff规则；X衍射图；碱基不可滴定。要点（1）两条链反向平行，绕同一轴相互缠绕成右手螺旋；（2）磷酸和戊糖交替处于螺旋外围，碱基处于内部，形成碱基对；(3) 双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm；（4）一条链的核苷酸序列可以决定另一条互补链的核苷酸序列。大部分真核生物中有5种组蛋白，两栖类、鱼类和鸟类还有H5以替代或补充H1。染色质是由许多核小体组成的，H2A，H2B，H3和H4各2个分子构成的8聚体是核小体的核心部分，H1的作用是与线形 DNA结合以帮助后者形成高级结构。RNA聚合酶(DDRP)E. coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（ a2 b bb s）a36512决定哪些基因被转录b150618催化功能b155613结合DNA模板s70263辨认起始点原核生物的 RNA聚合酶都受一类抗结核药利福平或利福霉素的特异性抑制。 分子伴侣 分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。 Attenuation (衰减作用) : a regulation at the transcription termination step & a second mechanism to confirm that little tryptophan is available真核基因的复杂性5 真核基因组更大.大肠杆菌基因组有4 106 bp,人单倍体基因组有3109 bp ,是其800倍;是嗜菌体基因组的10万倍.7 大肠杆菌有4千个基因,人有近10万个基因10 原核生物基本是单倍体,真核生物是2倍体. 11 真核生物DNA与组蛋白等构成染色质染色体,被包裹在核膜内;有核外遗传(mtDNA)真原核基因结构比较1 原核基因按功能成串排列,组成操纵子单位,转录产物为polycistron; 真核生物一个结构基因转录为monocistron.2 原核有转录与翻译的偶连,真核表达则有严格的时区间隔 .4 原核大部分基因是编码序列,而真核大部分是调控序列5 原核为蛋白质编码的大部分是连续基因; 真核为蛋白质编码的是断裂基因,在转录后经剪接去除内含子,才能翻译获得完整的多肽,这就增加了表达的调控环节.7 原核生物除rDNA,tDNA外,很少有重复序列;真核含大量的repetitive sequences: high _:10-300bp,占人基因组的20%,功能不明,重复103以上 moderate_:300-500bp,占基因组10-40%, 5s, tRNA,组 蛋白基因, 10103 single copy sequences:基本不重复,占50-80%(人65%) 大多数蛋白质的编码基因. 真核基因调控特点1 调控环节更多 同原核一样,调控主要发生在转录水平;但无转录翻译偶连,且转录翻译后有复杂的信息加工过程1 转录与染色质的结构变化有关 1. 间期核染色质: 异染色质hetrochromatin高度压缩,不转录; 常染色质euchromatin,较松散;其中10%为active chromatin.超螺旋松弛. 活性非活性 2.组蛋白能非特异性的阻遏转录. 组蛋白为碱性,易与带负电的磷酸基结合,从而遮蔽了DNA分子 3.非组蛋白具细胞组织特异性,能特异的去除组蛋白的阻遏作用,有利转录. 4.DNA甲基化能阻碍转录因子与DNA特定位点的结合, 影响转录1 以正性调控为主 真核启动子对RNA聚合酶亲和力低,需要多种激活蛋白的协同作用.转录调控蛋白有激活,阻遏或二者兼有,但以激活为主3 适应环境的瞬时调空是可逆的,而发育控制调控是不可逆的,决定细胞生长,分化,发育的全过程真核基因表达调控的环节1 DNA水平:基因数量,结构2 转录水平:顺式作用元件与反式作用因子3 转录后水平:mRNA的加工成熟5 翻译水平:起始复合物及mRNA稳定性6 翻译后水平:蛋白质加工修饰DNA水平的调控1 基因的丢失 如：马蛔虫胚胎发育过程中有27% DNA的丢失1 染色质丢失 某些低等真核生物,在细胞分化过程中,有部分染色质断裂删除和异染色质丢失,之后才成为表达型基因.1 基因扩增 指某基因的拷贝大量增加.如非洲爪蟾卵母细胞rDNA的扩增,以满足受精后合成大量蛋白质的需要1 基因重排与变换 将一个基因从远离启动子处移到启动子附近从而启动转录称基因重排. 典型例子是lg基因的成熟,通过染色体内DNA重组将相距甚远的基因片段连接起来,产生具有表达活性的特异lg基因 酵母细胞能通过一种”交配型转换”来完成性别交换,即某基因复制后置换掉原有的另种基因 1 DNA甲基化与基因活性的调控 2 DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导基因活化与表达二、转录水平的调控（一）顺式作用元件(cis-acting elements) 真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。1 启动子（promoter) 位于转录起始点附近，且为转录起始所必需的序列。 2 增强子（enhancer) 增强子指位于离转录起始点较远的位置上，具有参与激活和增强起始功能的序列元件。3 绝缘子(Insulator)绝缘子是一种负调控元件，参与基因表达的负调控。绝缘子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。4 转座子(Transposon)转座子（transposable element）的基因调控可能是由于转座元件的插入，带来新的序列特异性的结合位点，这些序列可以象增强子的作用方式远距离地调控基因转录。（二）反式作用因子一种基因的蛋白质产物，能影响位于基因组另一条染色体上的（或基因组别处的）另一个基因的活性，这种作用叫做反式作用。参与这种反式作用的特定因子叫做反式作用因子，一般指的是蛋白质，它能够通过同顺式作用元件（DNA）之间的相互作用而影响基因的表达。 1）基本转录因子(Basal factor): 和RNA聚合酶一起结合于起始点和TATA盒；2）激活剂(activator)： 特异性识别短共有序列元件的转录因子。它们结合于启动子或增强子位点上。通过增加基本转录复合体(basal apparatus)结合于启动子的效率而起作用；3）辅激活剂(coactivator): 连接了激活剂和基本转录复合体；4）一些调节因子(Some regulators)： 可使染色质结构改变。3 反式作用因子中的DNA识别或结合域反式作用因子有多种类型的DNA结合域。（1） 螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix）（2） 锌指结构（zinc finger motif）（3） 亮氨酸拉链（leucine zipper）（4） 螺旋-环-螺旋( helix-loop-helix, HLH )三、转录后水平的调控（一）RNA的加工成熟1 rRNA和tRNA的加工成熟 rRNA：分子内切割和化学修饰 tRNA：内含子切割和化学修饰2 mRNA的加工成熟 5 端加帽子； 3 端加poly(A)； RNA的剪接； 核苷酸的甲基化修饰（二）翻译水平的调控1 mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成起始2 mRNA 帽子结构的识别与蛋白质合成3 mRNA的稳定性与基因表达调控4 可溶性蛋白因子修饰与翻译起始调控（三）翻译后水平的调控1 蛋白质的易位2 蛋白质的折叠和加工3 蛋白质的寿命 1.真核基因调控特点 2.顺式作用元件包括哪些 3.mRNA的加工成熟过程mRNA剪接的种类：3 组成型拼接: 一个基因的mRNA前体按一种方式剪切，产生一种mRNA，一种蛋白质。9 可变剪接（选择性拼接，alternative splicing） ：有些基因的mRNA前体，按不同方式剪切，产生两种以上mRNA，翻译产生多种蛋白质。1.2 可变剪接的方式：（1）选用不同的起始位点，得到不同的蛋白质；（酵母蔗糖酶Suc基因 ，小鼠-淀粉酶基因）；（2）选用不同的加尾位点产生不同的蛋白质（如免疫球蛋白）；（3）选用不同的剪接位点；（4）同时采用以上两种方式；5 顺式剪接（cis-splicing）：内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接。7 反式剪接（trans-splicing）：不同基因的外显子剪接后相互连接。3. RNA 编辑3.1 编辑的发现4 RNA编辑（editing） 指遗传信息在mRNA水平上发生改变的过程。即RNA的编码序列与转录产生它的DNA序列不同，转录后的RNA在编码区发生碱基的加入，丢失或转换等现象。6 1986年R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现m RNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，7 1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。3.2 编辑的生物学意义：1 (1) 校正作用；2 (2) 调控翻译；3 (3) 扩充遗传信息。2 RNA编辑相继在真核生物和病毒中发现: 如小鼠脑中的谷氨酸受体，哺乳动物载脂蛋白B，植物线粒体中的细胞色素氧化酶亚基。1 editing signal? editosome structure?1 生物学意义 生物适应中的保护措施之一 中心法则的发展：改变DNA的信息，使DNA abbreviated缩短, 称为cryptic隐藏的 gene, crytogene真核生物主要采用正控制模式无调节蛋白存在时，基因关闭有调节蛋白存在时，基因开启1 真核RNA pol 对其启动子的亲和性2 转录的启动是依赖多种激活蛋白的作用（与多个顺式元件结合）。真核生物正调控的必要性和优越性4 特异性: 真核基因组很大,某种顺式元件出现的几率高。这种情况下,保证基因特异表达的方法之一是使用多个调控蛋白,并同时与顺式元件结合形成复合物,才能启动转录, 而且必须是正调控。如果是负调控,只要有一个调控蛋白与顺式元件结合,即可关闭基因。 一个多细胞生物基因的调节位点(顺式元件)至少是5个。 由于一种顺式元件可与多个调控蛋白结合, 几个不同的顺式元件以适当有功能的方式排列在一起的随机性几乎没有，也保证了基因的特异性表达。1 经济:在分化了的细胞中,只须表达一部分(套)基因,其他的关闭。例如有100个基因,10%表达,90%关闭。 如果是负控制,须90种阻遏物; 如果是正控制,只须10种激活物，减轻蛋白质合成的负担。1 什么是顺式作用和反式作用? 顺式作用元件和反式作用元件有哪些？什么是反式作用因子？2 反式作用因子/转录因子的结构特征,各部分的结构特点。3 可变剪接的概念,意义,产生原因是什么。4 RNA的编辑,产生过程,意义。5 真核生物的基因调控有什么特点？基因组学（genomics）是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，只要研究生物体全基因组（genome）的分子特征。一遗传图谱（genetic map）又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。物理图谱（physical map）是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。1 转录图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。 序列图谱随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱 1 功能基因组的任务是进行基因组功能注释（Genome annotation）认识基因与疾病的关系掌握基因的产物及其在生命活动中的作用四张图：物理图、转录图、遗传图、序列图“人类基因组计划”是解读人的基因组上的所有基因，共分析24个染色体DNA分子中的四种碱基对。30亿个碱基对是一个很长的序列，为了更好地搞清这个长序列，需要有其他辅助工作配合。在“人类基因组计划”中，分为两个阶段：DNA序列图以前的计划和DNA序列图计划。序列图以前的计划包括物理图、转录图、遗传图。人类基因组的物理图有两个要素：一是序列，二是位置。在如此长的序列中，物理图就像地图一样标明各个序列的路标。通过分子杂交的办法，利用DNA双链互补特点，一个DNA片段杂交在这个位置，“说明这个位置的结构与它相似，就是这个位置的标记，这是以序列作为标记的位置。”物理图还有更重要的作用，有了前面标志的序列位置，就可以将克隆的DNA片段，一个一个接起来。据中国人类基因组计划负责人杨焕明教授说：“如果两个克隆的DNA 片段，都含有某一路标的序列，就说明这两个片段的一部分是重叠的。我们整个基因组的DNA就是由这些相互重叠的DNA片段全部覆盖。换言之，这些DNA片段，就是我们人类基因组这一区域的代表，这些片段的克隆就是我们研究这一区域的实验材料。”简述乳糖操纵子的正负调控机制答案要点：包括正负调控两种（）阻遏蛋白的负调控当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵子结构基因。当无诱导物时，阻遏蛋白结合与启动子与蛋白质部分重叠不转录。（=）CAP正调控当细胞内缺少葡萄糖时ATPCAMP结合，CRP生成CAP与CAP位点结合，增前RNA聚合酶转录活性。当有葡萄糖存在时CAMP分解多合成少，CAP不与启动子上的CAP位点结合RNA聚合酶不与操纵区结合无法起始转录结构基因表达下降。2.简述转录的基本过程?答案要点： 转录的基本过程包括：模板的识别；转录起始；通过启动子；转录的延伸和终止。 要求叙述各过程设计到的因子。3.简述原核和真核细胞在蛋白质翻译过程中的差异.答案要点：(1、起始因子不同； (2、翻译过程（肽链延伸）因子不同； (3、终止因子不同。要求详述其差异。4.试比较原核和真核细胞的mRNA的异同答案要点：真核生物5端有帽子结构大部分成熟没mRNA 还同时具有3多聚A尾巴，原核一般没有；原核的没mRNA 可以编码几个多肽真核只能编码一个。原核生物以AUG作为起始密码有时以GUG，UUG作为起始密码，真核几乎永远以AUG作为起始密码。原核生物mRNA半衰期短，真核长。原核生物以多顺反子的形式存在，真核以单顺反子形式存在。1.衰减子 答案要点：在色氨酸操纵子中，当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，否则，转录总是在长162bp的前导区终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域被称为衰减子。2.DNA拓扑异构酶答案要点：DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类，大肠杆菌的蛋白(MW-110000)就是一种典型的拓扑异构酶.它的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，然后再将切断的单链DNA连接起来，而不需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase)则的典型的拓扑异构酶，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。3.基因表达答案要点：遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程。4.前导肽答案要点：分析色氨酸操纵子前导肽的序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA；如果翻译起始于AUG，应该产生一个14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽（实际上还没有观察到）。5.启动子答案要点：启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。6. DNA分子克隆技术答案要点：（也称基因克隆技术） 在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA